两篇Science | 诺奖得主Doudna揭示CRISPR起源的VIPR系统，解析"非连续"RNA引导DNA识别机制|crispr|dna|rna|亚基|基序|蛋白

撰文 | 格格

RNA引导系统通过引导RNA与靶标的连续碱基互补配对实现可编程识别，广泛介导从移动遗传元件传播到适应性免疫的多种功能；在CRISPR-Cas系统中，这一机制赋予原核生物适应性免疫，并催生了跨越所有生命域的生物技术工具。CRISPR-Cas依据效应蛋白分为两类，其中更为丰富的Class 1被认为最早演化出来【1】，其标志性特征是含有重复序列相关神秘蛋白（RAMP），这些蛋白在CRISPR RNA上寡聚化形成RNA引导的效应复合物，是CRISPR-Cas中最保守的组分，据推测可追溯至最后通用共同祖先【2】。然而，尽管适应模块已明确追溯至casposons转座子，Class 1多亚基效应复合物的起源仍然模糊，其从何种古老蛋白演化而来、如何获得RNA引导功能均缺乏直接证据；同时，即使对于已表征的CRISPR-Cas系统，靶标搜索与识别的基本物理机制仍存争议，R-loop形成的可逆性意味着完全匹配靶标的识别概率可能极低，一维扩散的贡献程度与超螺旋的调控作用尚未澄清；此外，RAMP蛋白虽共享RNA识别基序，但不同亚型中Cas7结合crRNA的扭转角差异显著，导致螺旋节距变化，这种结构可塑性与功能特异性的关系仍待阐明。

近日，Science杂志同期发表了两项来自诺贝尔化学奖得主、加州大学伯克利分校Jennifer Doudna团队的研究成果：A noncontiguous code for RNA- guided DNA recognition at the origin of CRISPR- Cas和VIPR RNA- guided DNA recognition by noncontiguous geometric triplex formation。两项工作旨在通过鉴定祖先型RAMP追溯CRISPR-Cas的演化起源，并由此发现了采用GGY/NN交替基序与“跳碱基”规则进行非连续配对的噬菌体VIPR系统，进而通过21个冷冻电镜结构揭示了其以右手螺旋丝组装、经几何三链体实现非连续RNA引导DNA识别的分子机制。

在第一项工作中，为了探寻CRISPR-Cas的演化起源，研究人员利用RAMP蛋白共享的结构特征（RRM核心、G-loop和拇指结构域）进行结构相似性搜索，发现了一个此前未报道的大规模RAMP同源蛋白家族，并将其所在系统命名为VIPR（病毒干扰可编程重复）系统。该系统极为精简，通常仅编码Vipr蛋白和辅助蛋白Vap，主要存在于噬菌体和古菌病毒基因组中，而非细胞基因组。系统发育分析表明，Vipr蛋白形成独立于所有CRISPR RAMP的早期分支，且缺乏CRISPR RAMP的衍生特征，提示其代表在CRISPR RAMP辐射之前就已分化的祖先型RAMP谱系。小RNA测序鉴定出约100 nt的vrRNA，与Vipr蛋白共纯化形成稳定复合物；序列分析揭示vrRNA由9至16个YNNGG串联重复组成，形成交替的保守GGY基序与高变NN二核苷酸。基于Class 1 CRISPR中拇指结构域周期性破坏配对的先例，研究者提出GGY不参与配对、NN负责靶标识别的假设，并通过生信搜索、体外结合与体内GFP沉默实验证实了“1-nt跳跃规则”。该识别不需要PAM，可靶向双链任意一条链，特异性完全可通过改变NN重新编程。天然靶标预测与功能实验揭示VIPR系统参与噬菌体间冲突，既能抵御入侵噬菌体，也能迫使溶源噬菌体进入裂解。VIPR系统可分为七个类型，其中III型和V型富集于宿主染色体防御岛、靶向病毒序列且编码预测核酸酶，提示其已从病毒间竞争被宿主劫持改造为抗噬菌体免疫；研究者据此提出，现代CRISPR系统的直接祖先可能经历了类似轨迹。

而在第二项工作中，为阐明VIPR如何实现非连续RNA引导DNA识别，研究人员解析了21个VIPR核糖核蛋白复合物的冷冻电镜结构，涵盖二元、部分接合中间态和完全接合三元状态。二元结构显示，Vipr蛋白沿vrRNA寡聚化形成右手螺旋丝，每个重复单元结合一个原体，螺旋具六亚基周期性和约72 Å螺距。Vipr采用与CRISPR RAMP相同的RNA结合模式，相邻两个原体协同将GGY三碱基逐出配对，将NN定位以进行带缺口的靶标配对，使特异性完全由可编程的NN决定，且该机制在SUSP1与P. fulva系统中高度保守。三元结构显示，DNA结合后丝收缩，周期由六亚基变为五亚基，螺距减至约66 Å。拇指结构域周期性打断向导-靶标双链，在向导上逐出全部GGY，在靶标上仅逐出跳跃碱基x3，实现NN配对；向导Y3与靶标x3朝向相反，类似Class 1 CRISPR中的反平行碱基翻转。此外，非靶标链穿过双链形成“几何R-loop三链体”，三条链共享约66 Å螺距，但RNA每圈约25个核苷酸、DNA链各约15个，形成不对称几何；该结构由Vipr蛋白两端钳制非靶标链维持。三链体形成要求第三链为DNA。与完全配对双链DNA孵育捕获了5至11亚基的多种构象，揭示解旋与R-loop形成过程：RNA-dsDNA三链体始终位于前导边缘，R-loop三链体紧随其后，两者间仅靶标链位置变化，据此提出Vipr结合先构建三链体支架、随后局部靶标链移交逐步完成R-loop的模型。

总之，两篇工作通过结构引导的挖掘策略发现了噬菌体编码的VIPR系统——一种比CRISPR-Cas更古老的祖先型RNA引导DNA识别系统，其vrRNA以交替GGY/NN基序和“1-nt跳跃规则”实现非连续配对，无需PAM即可靶向双链任意一条链；进而通过21个冷冻电镜结构阐明了Vipr蛋白沿vrRNA组装为螺旋丝、经几何R-loop三链体完成靶标链移交的分子机制。该发现不仅揭示了RNA引导DNA识别的一种全新编码逻辑，为CRISPR-Cas起源于病毒间军备竞争提供了直接证据，也提示了从病毒防御系统向宿主适应性免疫演化的路径，并为开发新型可编程基因调控工具提供了潜在原型。