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Introduction
牛奶富含蛋白质、维生素、钙等人体必需营养素，是广受青睐的营养食品，但牛奶中的部分蛋白质可能引发过敏反应，给人体健康带来潜在风险。牛奶过敏症状轻重不一，轻则出现皮肤红疹，重则可能引发危及生命的过敏性休克，已成为食品安全领域的重点关注问题。在牛奶含有的多种蛋白质中，β-乳球蛋白（β-LG）作为脂质运载蛋白家族成员，是主要过敏原之一，约占牛奶总蛋白的12%、乳清蛋白的50%，流行病学调查显示，约82%的牛奶过敏人群会对β-LG产生特异性反应。
目前，食物过敏尚无有效预防手段，严格避免接触过敏原是主要防控方式。但食品生产过程中可能因交叉污染导致β-LG意外混入，因此食品制造商需标注过敏原信息，而对食品中β-LG的常规检测，是保障食品无过敏原、标签标注准确及乳制品安全消费的关键。
现有β-LG检测方法包括仪器分析、聚合酶链式反应（PCR）、免疫分析等。高效液相色谱（HPLC）虽准确性和灵敏度高，但依赖昂贵设备、样品前处理繁琐且耗时；PCR技术检测快速，却成本较高且易出现假阳性；免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、快速经济等优势，是β-LG快速鉴定的成熟方法。
电化学生物传感器结合了传感设备微型化与生物分子高特异性，可将生化信号转化为电化学信号实现精准检测。与需标记生物分子的传统传感器相比，无标记电化学生物传感器简化了流程、降低了成本，应用前景更广阔。为实现信号放大，多种纳米材料被用于修饰电极界面。立方Ia3d结构介孔碳（CMK-8）导电性、稳定性优异，但无电活性；普鲁士蓝（PB）电化学活性突出，却在中性和弱碱性环境中稳定性差；金纳米颗粒（AuNPs）导电性与生物相容性良好，可作为生物分子固定载体。
基于此，本研究构建了基于AuNPs/PB/CMK-8复合材料的无标记电化学免疫传感器，通过CMK-8修饰电极并电聚合PB形成redox活性层，再沉积AuNPs以增强电子传递和固定特异性抗体，利用抗体与β-LG的特异性结合阻碍电极表面电子传导，实现目标物检测，旨在为乳制品中β-LG过敏原提供准确、快速、灵敏的分析方法，助力食品安全检测与评价。
Results and Discussion
电极表征结果
通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）及能量色散X射线（EDX）分析对CMK-8、PB/CMK-8、AuNPs/PB/CMK-8修饰电极的表面形貌与元素组成进行表征。FE-SEM图像显示，CMK-8修饰电极呈现大量碳块结构，主要含C、O元素；原位沉积PB后，电极表面附着大量球形颗粒，EDX能谱检测到N、K、Fe元素，证实PB成功电沉积；进一步沉积AuNPs后，电极表面形貌发生明显变化，元素mapping图像证实Au元素存在，表明AuNPs成功负载于PB/CMK-8/GCE表面。
图2 （A-C）CMK-8/玻碳电极（GCE）、普鲁士蓝（PB）/CMK-8/玻碳电极（GCE）和金纳米颗粒（AuNPs）/普鲁士蓝（PB）/CMK-8/玻碳电极（GCE）的SEM图像；（D）金纳米颗粒（AuNPs）/普鲁士蓝（PB）/CMK-8/玻碳电极（GCE）中碳（C）、氮（N）、铁（Fe）和金（Au）的元素mapping图像
电极电化学行为
采用差分脉冲伏安法（DPV）对传感器制备过程中的电极电化学行为进行监测。结果显示，PB/GCE电极在0.15 V处出现明显还原峰，对应PB向普鲁士白的转化；PB/CMK-8/GCE的峰电流显著增大，表明高导电性的CMK-8提升了电极界面导电性，促进电子转移，放大了DPV信号；AuNPs/PB/CMK-8/GCE表现出更高的峰电流和更低的背景电流，得益于AuNPs的优异导电性及与CMK-8的协同作用。
抗体固定后，电极峰电流显著下降，因抗体占据了电极表面活性位点，阻碍了界面电子交换；牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性结合位点后，峰电流进一步降低，形成电化学屏障，抑制电子传输与离子扩散；与β-LG孵育后，DPV响应进一步减弱，证实免疫复合物形成，传感界面构建成功，可通过峰电流变化（ΔI）实现β-LG的定量分析。
实验条件优化
电极构建参数优化：PB电沉积循环数为30时电流响应最佳，过多循环会因PB层过厚阻碍电荷转移；AuNPs最佳沉积电位为-0.2 V（此时峰电流达375 μA），最佳沉积时间为180 s，延长时间会因AuNPs过量掩盖PB还原峰。
免疫结合反应参数优化：抗β-LG抗体的最佳浓度为0.1 mg/mL，此时ΔI达最大值138 μA，进一步增加浓度则因活性位点饱和导致ΔI不再上升；缓冲溶液最佳pH为6.0，碱性条件下PB稳定性下降；最佳孵育温度为37 ℃，过高温度会破坏蛋白质结构与活性；最佳孵育时间为60 min，此后免疫复合物达到饱和，ΔI趋于稳定。
图4 （A）普鲁士蓝（PB）电沉积过程的循环伏安（CV）曲线；（B）普鲁士蓝（PB）电沉积循环数对差分脉冲伏安（DPV）电流的影响；（C）金纳米颗粒（AuNPs）电沉积电位的优化；（D）金纳米颗粒（AuNPs）电沉积时间的优化
传感器分析性能
线性范围与检出限：在0.01～100 ng/mL的β-LG浓度范围内，传感器ΔI与β-LG浓度对数呈良好线性关系，回归方程为ΔI＝36.69 lgρ＋95.18（R²＝0.99702），检出限（LOD，S/N＝3）低至4.72 pg/mL，表现出宽线性范围和高灵敏度。
特异性与抗干扰性：以α-乳清蛋白（α-La）、乳铁蛋白（Lf）、酪蛋白（Cas）为干扰物，传感器对10 ng/mL β-LG的ΔI值达140 μA，而对100 ng/mL干扰蛋白的信号响应微弱（24.7 μA以下）；即使在干扰蛋白浓度为β-LG 10倍的混合体系中，传感器对β-LG的电化学响应仍不受影响，证实其具有优异的特异性和抗干扰能力。
重复性与稳定性：5支平行电极检测10.0 ng/mL β-LG 的相对标准偏差（RSD）为3.2%，重复性良好；电极在4 ℃储存8和15 d后，DPV响应仍分别保持初始值的89.1%和85.4%，稳定性优异。
图6 （A）AuNPs/PB/CMK-8/GCE对不同浓度β-LG过敏原的差分脉冲伏安（DPV）响应；（B）DPV电流变化值（ΔI，μA）与β-LG浓度的校准曲线；（C）电化学免疫传感器对β-LG检测的选择性；（D）电化学免疫传感器对β-LG检测的抗干扰能力；（E）电化学免疫传感器对β-LG检测的重现性；（F）电化学免疫传感器在不同储存时间（0～15 d）下对β-LG（10 ng/mL）检测的稳定性
实际样品分析
采用构建的无标记电化学免疫传感器对纯牛奶、婴儿配方奶粉、冰淇淋等实际乳制品中的β-LG进行检测，并与商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒对比。样品加标回收实验结果显示，回收率在89.2%～98.8%之间，RSD为1.2%～3.1%（n＝3）。与其他β-LG检测方法相比，该传感器线性范围更宽、灵敏度更高，检测时间仅需30 min，适用于乳制品中β-LG过敏原的快速筛选与定量分析。
Conclusion
本研究成功开发了一种基于AuNPs/PB/CMK-8复合材料的无标记电化学免疫传感器，用于乳制品中β-LG过敏原的高灵敏度检测。该传感器通过CMK-8提供的高比表面积和良好导电性、PB优异的电化学活性以及AuNPs对电子传递的促进和生物分子固定的载体作用，三者协同作用显著增强了电化学信号响应，赋予传感器优异的检测性能。
实验结果表明，该传感器对β-LG的线性检测范围为0.01～100 ng/mL，检出限低至4.72 pg/mL，同时具备良好的特异性、抗干扰性、重复性和稳定性。在纯牛奶、婴儿配方奶粉、冰淇淋等实际乳制品检测中，回收率令人满意，RSD较低，验证了其实际应用潜力。与现有检测方法相比，该传感器无需标记、操作简便、检测快速、成本较低，为β-LG过敏原的快速筛查与定量分析提供了高效解决方案。
此外，本研究构建的传感器体系具有良好的通用性，通过更换特异性识别分子，可拓展用于食品中其他有害物质的检测，为食品安全检测技术的发展提供了有价值的参考。该传感器在食品安全监督、食品生产过程质量控制等领域具有广阔的应用前景，有助于进一步保障消费者的饮食安全。
Signal amplificated electrochemical immunosensor for β-lactoglobulin allergen detection in dairy products applying AuNPs/Prussian blue/CMK-8 composite
Jingying Yanga, Lin Lia, Xinmiao Maa, Shuo Wanga,b,*, Mingfei Pana,*
a State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Key Laboratory of Food Quality and Health of Tianjin, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
b Tianjin Key Laboratory of Food Science and Health, School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China
*Corresponding author.
Abstract
Herein, a novel label-free electrochemical immunosensor was fabricated via immobilizing specific anti-β-lactoglobulin (β-LG) antibodies (Abs) onto an integrated electrode of gold nanoparticles (AuNPs)/Prussian blue (PB)/cubic Ia3d structured mesoporous carbon (CMK-8). This immunosensor allowed for the quantitative detection of the major milk allergen β-LG. CMK-8 with excellent electrical conductivity and uniformly adjustable pore structure was modified on the glassy carbon electrode (GCE) and served as the sensitive substrate for the electro-polymerization of PB, forming the redox-active layer. AuNPs were subsequently electrochemically deposited on PB/CMK-8/GCE to improve the electrical conductivity and utilized as the connector for Abs immobilization. During β-LG detection, the Abs-modified AuNPs/PB/CMK-8/GCE exhibited a significant reduction in differential pulse voltammetry current signal when exposed to β-LG, displaying an inverse dose-dependent relationship. The developed electrochemical immunosensor demonstrated good detection performance for β-LG, with a wider linear range of 0.01–100 ng/mL and a lower detection limit of 4.72 pg/mL. Meanwhile, the sensor exhibited remarkable repeatability, reproducibility, stability and anti-interference capabilities, which was further applied to detect β-LG in dairy food, achieving satisfactory recoveries (89.2%–98.8%) and lower relative standard deviation (≤ 3.1%). Therefore, this innovative electrochemical method for food allergen detection holds great potential application in food safety determination and evaluation.
Reference:
YANG J Y, LI L, MA X M, et al. Signal amplificated electrochemical immunosensor for β-lactoglobulin allergen detection in dairy products applying AuNPs/Prussian blue/CMK-8 composite[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250198. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250198.
翻译： 张庆芬（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：摄图网
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