生物分子的催化功能和其他复杂功能，取决于三维空间中大量原子的精确排布。近日，华盛顿大学蛋白质设计研究所的Rohith Krishna和David Baker团队，在Science发表题为《Atomic functional site scaffolding in biopolymers with RFdiffusion3》的研究，他们开发了RFdiffusion3，用自由原子扩散满足复杂原子约束，并把它用于酶、RNA和蛋白-核酸杂合体的功能位点设计，还通过实验验证了磷酸三酯酶和锌蛋白酶。值得一提的是，昨日David Baker团队在Nature连发两篇原创研究论文，近日再发Science，实现两天顶刊三连发！详见报道，
RFD3把蛋白质和核酸都放到原子层面处理，每个蛋白残基用4个主链原子和10个侧链原子表示，较小侧链用β碳上的虚拟原子补齐，核酸按RNA的12个骨架原子、DNA的11个骨架原子和11个碱基原子构成，统一模型最多覆盖23个原子。研究团队采用类似AlphaFold3扩散模块的Transformer U-Net架构，用稀疏注意力关注局部相互作用，并用交叉注意力在原子和token之间传递信息。网络去掉三角乘法和三角注意力更新，把Fairformer从48层压缩到2层，最终约1.68亿可训练参数，推理速度比前代扩散模型快一个数量级。
训练数据覆盖PDB中的蛋白、小分子、核酸和蛋白-核酸复合物，也加入AF2蒸馏结构和RoseTTAFold3预测的RNA结构，蛋白序列后续用ProteinMPNN或LigandMPNN设计，RNA序列由模型直接生成。在Eterna OpenKnot的57个RNA谜题上，RFD3比RFDpoly取得更高的三维结构共设计率，LDDT大于0.9的谜题有21个对10个，RMSD小于4 Å的谜题有9个对5个。针对AMP和FMN的适配体设计中，每个靶标产生1200个设计，4 Å配体RMSD阈值下约1%成功，8 Å阈值下约25%。
在酶设计方面，RFD3把催化残基作为额外token加入扩散，他们在M-CSA的原子模体酶基准中，41个任务有37个优于RFD2，在四个含6个催化残基的活性位点中，催化残基和旋转异构体质量更好。研究团队把对称性约束加入生成过程，对15个天然C2对称案例生成催化残基排列一致的对称复合物，并用核糖核酸酶P活性位点演示RNA和蛋白残基共同参与的杂合支架。在磷酸三酯酶设计中，他们以对氧磷为底物，构建包含两个锌离子、一个氨甲酰化赖氨酸和六个催化残基的theozyme，96个设计找到4个活性克隆，ZAPP-1有kcat=0.015 s-1和kcat/KM=2.0 M-1s-1，六个催化残基突变都降低活性。
针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关靶点，研究团队设计能切割TTR纤维核心β链序列PAINVAHVHF的锌蛋白酶，他们用氨基肽酶N和astacin-底物复合物的几何信息构建theozyme，RFD3同时支架催化残基、确定底物构象并生成活性位点裂隙。96个设计中有56个在顺式实验中显示超过10%切割，TTRg11在反式FRET实验中一小时内切割大部分底物，它对同源底物的活性明显高于六条其他β淀粉样蛋白来源序列，并且依赖Zn(II)，其kcat=0.072 s-1，KM=70 µM，kcat/KM=1100 M-1s-1。RFdiffusion3把蛋白、RNA和蛋白-核酸杂合体的原子级功能位点支架统一在一个生成框架中，并为复杂酶和核酸设计提供了可实验验证的路径。
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