下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以分析蛋白和蛋白互作关系。
1.优点
（1）无法进行体内互作检测的可以进行此项目；
（2）当无法获得在体样本或者在体样本没有特异性一抗可以使用但是又必须进一步验证蛋白互作结论时，用到了pull down实验；
2.缺点
（1）周期长，价格贵：主要是需要构建蛋白表达载体，蛋白纯化后才能做实验；很多时候蛋白不一定能表达出来，载体也需要多次尝试；
（2）结果可靠性：高于双荧光素酶，低于coip实验，体外将2个蛋白放一起，排除了其他的干扰；
3.实验步骤
3.1载体构建
常规使用标签：GST、HIS、MBP等，对应这些标签的载体很多，常规是PET系列（28a等）和PGEX载体系列（4T1等）；不同的蛋白在载体上表达效果不同，也有可能表达在包涵体中，导致无法纯化，其中有时候需要对载体进行改造促使蛋白促溶，均需要载体构建进行尝试；
3.2蛋白表达预实验
（1）将构建好的载体转入BL21菌株中，通过PCR检测确定转化成功；
（2）将BL21细菌扩大培养，至OD=0.6-0.8时，加入IPTG；
（3）设置IPTG浓度，诱导时长以及诱导温度（浓度可以时0.3、0.5、0.7等，时长可以暂定16h或者12h等；温度可以时28℃或者16摄氏度等都可以）
（4）转速也会影响蛋白表达情况，可以暂定一个转速，到时间后，离心，收集菌体；
（5）加入PBS缓冲液，重选细菌，放入超声破碎仪中进行超声破碎；
（6）破碎后，4℃，离心，收集上清；
（7）上清加入Loadnig buffer变性，煮10min；
（8）Western blot检测表达效果；
3.3蛋白大量表达纯化鉴定
（1）通过上述预实验，选择合适的IPTG诱导浓度，诱导时间以及诱导温度，进行大量培养；
（2）收集全部上清，若使用GST标签蛋白，可以按GST成品纯化柱进行纯化浓度；
（3）考马斯亮蓝染色：取2ug GST-A, HIS-B加适量SDS-loading buffer，100度煮10min，上样进行蛋白电泳。
（4）电泳结束后，切胶，加入考马斯亮蓝染色液，过夜染色。
（5）用脱色液进行脱色至无背景。
3.4 Pull Down
（1）安装柱子，用PBS平衡柱子（加入使其自然流下）
（2）加入2 mL GST-A到一个封闭的GST柱子,4℃ rotate混匀6h。
（3）将孵育液流出后（收F1），用已预冷的300mL 1×PBS洗涤GST柱子约20次（6ml加入后上下盖子盖好颠倒混匀，打开流出），4℃；（流出的PBS要收集，洗涤液收集3管，刚开始，中间，最后，标为W1,W2,W3）
（4）将孵育过GST-A的柱子吸取介质40µL，加入loading buffer煮10 min后作为Input ，4℃备用，用于检测GST-A是否已经挂在柱子上；
（5）向柱子中加入2mL的HIS-B，4℃孵育过夜，并且取40 μL蛋白作为HIS-B加入loading buffer煮10 min后作为质控，4℃备用；
（6）流出孵育液后（收F2），用预冷的1×PBS 200 mL洗涤大约15次；（流出的PBS要收集，洗涤液收集3管，刚开始，中间，最后,标为W4,W5,W6）
（7）取40ul介质(IP1)，加SDS loading煮10min后4℃备用，用于检测HIS-B蛋白是否和GST-A蛋白互作。
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