先天性心脏病是最常见的出生缺陷，在大多数心脏手术中，患者接受体外循环（CPB），以尽量减少心脏手术时的缺血性损伤。不良的术后结局与 CPB 手术期间和之后的严重全身炎症反应有关。在 CPB 患者的血浆中一直观察到促炎细胞因子，特别是 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的激增。
尽管全身炎症与器官损伤密切相关，但其发生机制尚不清楚。一个主流假设是 CPB 激活炎性白细胞，在 CPB 后外渗并浸润到不同的器官，导致器官功能障碍。炎性白细胞（包括分化的巨噬细胞）将细胞因子和破坏性可溶性因子释放到周围组织，这些细胞也可能在浸润时死亡，因为 CPB 和特别高的剪切应力被证明能够诱导单核细胞死亡。坏死是细胞死亡的炎症模式，被认为比细胞凋亡更具破坏性。迄今为止，CPB 激活的白细胞死亡和细胞死亡的确切模式（如果确实发生）的实验证据仍然缺乏。
基于此，美国华盛顿大学医学院心脏病学系、加州大学圣地亚哥分校医学院医学系及西奈山伊坎医学院心血管外科团队的一项研究曾使用儿科患者样本、幼猪 CPB 模型和新开发的体外 CPB 模型来表征 CPB 及其特异因子如何诱导全身炎症的分子机制。研究确定了高剪切应力是一种 CPB 特异性因子，足以通过钙依赖性信号通路显著上调人单核细胞中 IL-8 和 TNF-α 的生成；且发现 CPB 诱导的大量炎性单核细胞亚群死于细胞凋亡和 TNF α 介导的坏死性凋亡，这可能导致 CPB 后的组织损伤。研究成果发表于 JCI Insight 期刊题为“Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes”。
首先，对新生儿心脏手术患者采集的白细胞进行 mRNA 测序。每簇基因的通路富集分析表明，在所有时间点，骨髓细胞都有很强的活化，特别是粒细胞粘附以及 IL-6 和 IL-8 信号。随着时间推移，胞吐作用、IL-10 介导的抗炎细胞因子信号、TLR 信号和白细胞迁移逐渐增加。细胞类型特异性基因集富集分析证实了骨髓细胞，尤其是单核细胞，是驱动整体转录反应的主要细胞类型。由于炎性细胞因子是 CPB 后患者全身炎症的标志，因此分析了 mRNA-Seq 数据中 IL1B、IL6、IL8 和 TNFA 4 种细胞因子的转录变化，儿科患者白细胞样本和幼猪 CPB 模型均显示仅发现 IL8 和 TNFA 的上调，而未检测到 IL6。这些数据表明，暴露于 CPB 条件足以上调白细胞中 IL8 和 TNFA 的表达。
为了研究 CPB 诱导单核细胞中细胞因子产生的分子机制，将 THP-1 细胞（一种来自婴儿的人单核细胞系）暴露于体外 CPB 条件中，并施加大范围剪切应力（图1 A）。与静态对照相比，体外 CPB 条件在 THP-1 细胞中强烈上调 IL-8 和 TNF-α 的转录物和蛋白水平（图1 B、C），IL1B 表达没有显著改变，且在2.1 Pa 剪切力处理的 THP-1 细胞中未检测到 IL-1B 和 IL-6 蛋白水平的变化。这表明，体外 CPB 回路在上调 IL-8 和 TNF-α 方面概括了体内 CPB 数据。
与 CPB 回路相关的三个因素是暴露于 PVC、高剪切应力和快速冷却/再加热。为了剖析每种因素的影响，将静态 THP-1 细胞与 PVC 管一起孵育，发现在 37°C 下单独暴露于 PVC 使 IL8 的分泌上调了约 5 倍，而 TNFA 水平没有显著改变（图1 D）。
当细胞在 37°C 下进行剪切处理以消除冷却/复温效应，或暴露于 0.63 Pa 的较低剪切应力下时，IL-8 和 TNF-α 在 mRNA 和蛋白质水平上的上调显著降低（图1 E、F）。特别是对于 IL8，在 2.1 Pa 高剪切应力和 30°C 低温的 CPB 条件下，与静态对照相比，IL8 水平提高了约 330 倍（图1 E）。
当细胞在 37°C 下承受 2.1 Pa 的高剪切应力时，与静态对照相比，IL8 上调约 124 倍（图1 E），这表明，冷却/复温的效果导致 IL8 水平的差异约为 2.7 倍。由于 PVC 暴露仅将 IL8 上调约 5 倍，因此推测与静态条件相比，剪切应力对 THP-1 细胞中 IL8 mRNA 水平提升的贡献最大。这种比较证明了剪切应力在 3 个 CPB 特异性因素中的主导效应，但没有考虑协同作用的可能性。
接下来，研究了钙是否对 CPB 激活的细胞因子生成至关重要。当细胞在无钙培养基中进行剪切处理或当钙离子螯合剂 EGTA 螯合细胞外钙时，与对照培养基相比，CPB 诱导的 IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 和蛋白质水平的上调明显减弱（图2），表明钙内流对于这种转录反应至关重要。
然后，利用抑制剂研究了特定钙介导的信号通路。结果观察到，MEK/ERK 通路的激活驱动 IL8 和 TNFA 的表达以响应 CPB。CPB 也激活了 CaN/NFAT 通路。剪切处理后人原代 CD14+ 单核细胞的 Western blot 分析也支持 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路的激活。PKC 抑制剂 Go 6983 和 Sotrastaurin 可有效抑制 IL8 和 TNFA 上调，但 Western blot 分析未显示 NF-κB 通路的激活，表明 PKC 抑制剂的抑制作用可能是由于 PKC 激活 MEK/ERK 通路的串扰。
由于钙信号通路可以串扰和募集不同的转录因子，因此检测了剪切处理的 THP-1 细胞中 4 种转录因子 NFAT、AP-1（p-c-JUN）、NF-κB p65 和 p-CREB 的核定位，发现只有 NFAT1 和 p-c-JUN 显示出明显的核定位，这被 EGTA 抑制，但未检测到 NF-κB p65 或 p-CREB 染色。这表明，MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 是 CPB 条件下激活的主要钙信号通路。
此外，与静态细胞相比，CPB 诱导的 IL8 启动子激活导致剪切处理的 THP-1 细胞的荧光素酶活性增加约 1.5 倍。当 AP-1 的结合位点 #1 或 NFAT 的结合位点 #2 被删除时，剪切后荧光素酶活性没有增加。这些结果证实，AP-1 和 NFAT 在这 2 个相邻结合位点的结合激活了 THP-1 细胞中的 IL8 转录。
研究发现，在暴露于体外 CPB 系统 2 小时后，大约 1.6% 的 THP-1 细胞立即破裂，可能是由于机械破坏。有趣的是，大量非贴壁 THP-1 细胞随着时间的推移而死亡，具有凋亡和坏死细胞死亡的形态特征。细胞凋亡检测发现，Q4 的活细胞群随着时间的推移显著减少，Q3 的早期凋亡细胞数量在 24 小时后增加到约 13% ，Q2 中的坏死细胞提示晚期凋亡细胞、原发性坏死细胞或继发性坏死细胞，在 24 小时后显著增加至约 40%。Western blot 分析显示，随着时间的推移，剪切处理的 THP-1 细胞中坏死性凋亡通路中关键蛋白（p-RIPK1、p-RIPK3 和 p-MLKL）的水平增加，凋亡标志物水平也增加。该结果表明，THP-1 细胞在 CPB 后死于细胞凋亡和坏死性凋亡。
最后，研究人员探讨了细胞死亡是由可药物因子/信号通路精确介导的，还是仅仅是机械损伤的不可避免的结果。暴露于 CPB 条件将 THP-1 细胞更换为新鲜培养基，发现可以挽救细胞死亡（图3 A、B）。实验假设，要么是破裂细胞的不溶性残余物，要么是剪切处理中的可溶性因子导致细胞死亡，然后发现从剪切后的培养基中去除残余物或将残余物添加到新鲜培养基中不会改变细胞死亡的百分比（图3 B）。这一结果强烈表明，剪切处理的 THP-1 细胞释放到上清液中的可溶性因子导致了细胞死亡。
由于 TNF-α 是已知的细胞死亡介质，因此研究了靶向可溶性 TNF-α 是否可以减少坏死性凋亡。用人源化 TNF-α 抗体处理的剪切 THP-1 细胞的坏死细胞死亡减少约 24%（图3 C）。介导 TNF-α 细胞效应的受体 TNFR1 的敲除可将坏死细胞死亡减少约 41%（图3 D），并降低了裂解 caspase-3 和 p-RIPK1 的水平（图3 E）。这些数据表明，细胞死亡部分是由 TNF-α 介导的。此外，当用人重组 IL-8、TNF-α 或两者处理初始静态 THP-1 细胞时，IL-8 和 TNF-α 的组合比单独使用 TNF-α 处理诱导更多的细胞死亡。这表明，虽然 IL-8 不直接诱导细胞死亡，但它可能与 TNF-α 协同作用驱动细胞死亡。
这项研究首次分析了新生儿 CPB 期间和之后循环白细胞的全球转录变化。总之，该研究通过证明单核细胞活化在全身炎症中的关键作用以及炎性单核细胞死亡在组织损伤中的关键作用，使我们更接近于从机制上解开 CPB 中复杂的全身性炎症反应。除了转化潜力外，该研究还为响应流体剪切应力的循环白细胞的基本生物学提供了潜在的新理解。
参考文献：Tu LN, Hsieh L, Kajimoto M, Charette K, Kibiryeva N, Forero A, Hampson S, Marshall JA, O'Brien J, Scatena M, Portman MA, Savan R, Benner C, Aliseda A, Nuri M, Bittel D, Pastuszko P, Nigam V. Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes. JCI Insight. 2021 Jan 11;6(1):e141341. doi: 10.1172/jci.insight.141341. PMID: 33232305; PMCID: PMC7821587.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33232305/或点击阅读原文
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