CRISPR-Cas9系统已经成为一种极具前景和变革性的基因编辑平台。它能够在目标基因位点产生位点特异性的双链断裂，从而促进靶向和定制化的遗传干预。在各种方式中，将Cas9蛋白与单链引导核糖核酸（sgRNA）核糖核蛋白（RNPs）直接递送是最直接和高效的方法，因为它无需转录和/或翻译过程。这种方法还具有最短暂的功能性，插入诱变的风险低，脱靶效应和免疫原性也较低，成为了基因编辑领域一种有吸引力的方法。通常，在体内对靶细胞进行编辑涉及一个多步骤的级联递送过程。载体需要在体内循环并分布到目标组织，然后被细胞内化并将CRISPR释放到细胞质中。然而，由于Cas9蛋白体积大（约160 kDa）、带正电，且sgRNA带强负电，将RNPs有效递送到精确的细胞内靶位点仍然是一个重大挑战。同时，RNPs的稳定装载对于体内基因编辑的成功至关重要，而各种纳米材料的提前泄漏是一个常见问题。迄今为止，已有多种将RNPs递送入细胞的方法被报道。然而，仍然缺乏一种有效的方法将RNPs装载到稳定的纳米复合物中并促进其释放到细胞质中，这限制了CRISPR-Cas9技术在基因治疗中的有效性和效力。因此，迫切需要合理设计具有强大蛋白结合能力和高效内涵体逃逸能力的载体，以克服级联递送障碍，从而推动基于RNP的CRISPR技术发展。
基于此，中国医学科学院药物研究所王朝辉研究员、首都医科大学附属北京友谊医院李新刚教授等人联合开发了一种带有伯胺的线性聚合物模板-聚（2-氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PAMA），用于后续掺入多种能够与蛋白质结合并破坏内涵体的配体。通过配体筛选确定了一种富含胍基苯甲酸的聚合物（PGBA），该聚合物在递送RNPs方面表现出高效率。PGBA能够多价展示胍基和苯基，从而与RNPs实现高效结合并形成稳定的复合物，即PGBA-RNP纳米颗粒。通过促进内涵体逃逸，PGBA促进了RNPs释放到细胞质中，从而在各种细胞类型中实现了显著的基因敲除。同时，该聚合物可以轻松标记，以确定细胞摄取与编辑效率之间的相关性，从而实现编辑细胞的富集。PGBA通过局部和全身注射均能有效诱导DNA裂解。
众所周知，前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）是一种肝脏产生的蛋白，它通过与低密度脂蛋白（LDL）受体结合并将其降解来调节血液中的LDL水平。降低PCSK9的水平可以增加LDL受体的数量，从而降低血液中的LDL胆固醇水平，PCSK9被公认为是继他汀类药物之后最有效的降脂靶点。团队制备了针对PCSK9基因的PGBA-RNP纳米颗粒，尾静脉注射后，观察到小鼠血清中PCSK9的水平降低到了正常水平的20%。此外，PGBA-RNP纳米颗粒还显著降低了小鼠血清中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，与对照组相比降低了约30%。上述结果表明，PGBA-RNP纳米颗粒通过其高效的RNP传递和内质网逃逸能力，成功地在小鼠肝脏中实现了PCSK9基因的编辑，从而降低了PCSK9的水平。PGBA作为一种多功能且高效的纳米平台，在基因治疗领域具有巨大的潜力。相关研究成果以“A Guanidinobenzol-Rich Polymer Overcoming Cascade Delivery Barriers for CRISPR-Cas9 Genome Editing”为题发表于2024年的Nano Letters。
PGBA-RNP NPs的制备及其基因组编辑和编辑细胞富集的机制概述
参考文献：Shuang Liang et al. A Guanidinobenzol-Rich Polymer Overcoming Cascade Delivery Barriers for CRISPR-Cas9 Genome Editing. Nano Letters 2024, 24, 6972-6870
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