香港大学袁国勇团队在香港肝炎患者体内发现新型病毒！|免疫|基因改造病毒|肝炎|袁国勇|诺如病毒

肝炎是一种常见疾病，病因包括病毒性感染、药物不良反应、自身免疫性疾病、代谢性疾病和胆道病理。研究估计，11%-35%的急性肝功能衰竭病例缺乏明确的病因。因此，导致传染性肝炎的一些原因尚不清楚。人圆环病毒是最近在法国和中国独立报道的圆环病毒科物种。该物种包括人类圆环病毒（HCirV）。在中国，HCirV首次在一名静脉注射吸毒者中被发现。一项后续研究确定另一名HCirV患者也是一名静脉感染艾滋病毒和丙型肝炎病毒（HCV）的静脉吸毒者。

同一时间，法国的研究人员使用宏基因组下一代测序，在一名患有不明原因肝炎的心肺移植受者中发现HCirV感染。这些研究人员通过原位杂交证实肝组织中的HCirV mRNA，表明病毒对肝细胞的向性。

近期，香港大学袁国勇、Siddharth Sridhar及其团队通过比较肝炎病例和无症状对照组中HCirV感染的流行率以评估HCirV作为病毒性肝炎病因的影响，描述了HCirV感染病例的临床概况和基因组流行病学，然后通过表达HCirV病毒样颗粒（VLPs）探测HCirV与人肝细胞系的结合。相关研究内容以“Human Circovirus in Patients with Hepatitis, Hong Kong”为题发表在《Emerging Infectious Diseases》。

研究内容

本研究获得278例肝炎患者和184例对照组的血清或血浆样本（表1）。肝炎的程度通常为轻度；大多数患者患有无黄疸型肝炎。临床研究小组在123例（44.2%）病例中明确肝炎原因；其余155例（55.8%）的病因不明。对于已确定病因的患者，病毒性肝炎（18.7%）和药物性肝损伤（17.9%）最常见。

表1 香港肝炎患者人环病毒研究中肝炎病例和无症状对照的临床和人口统计学特征

人体样本中HCirV的筛选结果

图1 香港肝炎患者人圆环病毒筛查研究结果

本研究使用Rep基因检测方法筛选来自肝炎病例和HCirV感染的对照样本，然后对阳性样本进行测序。在278例肝炎患者中，有10例（3.6%）经HCirV PCR检测呈阳性，但其中2例无法获得序列。在184例对照中，有1例（0.5%）患者的HCirV DNA检测呈阳性，但无法获得序列（图1）。

HCirV案例特征

表2 香港人圆环病毒感染患者的临床和人口统计学特征

图2 香港8例肝炎及人圆环病毒感染患者的肝功能测试动力学。A）患者1；B）患者2；C）患者3；D）患者4；E）患者5；F）患者6；G）患者7；H）患者8。

图3 HE染色研究人类圆环病毒在肝炎患者的肝脏切片。A、B）患者5的3区小管内，原始放大×10（A），原始放大×20（B）时，胆汁淤积（箭头）；C）患者8的嗜酸性粒细胞体（蓝色箭头），导管周围有中性粒细胞（绿色箭头）；原始放大倍数×10。

8例确诊的HCirV感染者的中位年龄为47.5岁；男性5例，女性3例（表2）。共有4例患者在肝炎发病3个月内接受器官移植或输血，4例患者免疫功能低下。所有患者都没有感染HCV或HIV。R因子提示5例患者胆汁淤积损伤，2例患者混合模式，肝细胞损伤1人。肝炎发作时间大于1天，在所有患者的血浆或血清中均可检测到HCirV DNA（图2）。

在4例免疫功能低下的患者中，3例为实体器官移植受者，1例正在接受神经母细胞瘤化疗（患者1）。患者1在3年后复发，最终死于基础疾病（图2）。在18个月的时间里，在所有血浆样本中均检测到HCirV。患者4（肾移植受者）和患者8（肝移植受者）在肝炎发作消退后的几个月内持续出现HCirV病毒血症。患者5（肝移植受者）患有急性肝炎，并伴有短暂性HCirV DNA检测阳性。患者5在第一次肝炎发作期间的肝脏组织学与胆汁淤积相一致，而患者8的组织学显示胆管周围有中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，没有急性细胞排斥反应的特征（图3）。、患者6为75岁男性，因发烧入院。血液检查显示肝实质功能障碍（图2）。鼻咽拭子逆转录拭子检测SARS-CoV-2阳性。

HCirV基因组与系统发育分析

图4 来自香港肝炎患者人圆环病毒研究的代表性圆环病毒和人圆环病毒的系统发育树

患者1获得完整的HCirV基因组。该菌株的基因组与其他圆环病毒株相似。基因组大小为2021 bp，与HCirV1Parink关系最密切，其核苷酸同源性为98.7%。患者1（HK P1）的HCirV全基因组和其他分离株的部分基因序列的系统发育树显示，与巴黎和云南两种菌株相关的菌株在香港传播（图4）。

HCirV免疫测定

图5 7例在香港肝炎患者研究中血清充足患者的IgM和IgG免疫印迹

HCirV Cap蛋白在大肠杆菌中表达。该肽在SDS-PAGE上显示一个25 kDa的条带。这些多肽在透射电镜下自发组装成VLPs。来自7例HCirV感染者的血清样本可用于使用基于HCirV VLP的免疫印迹法进行抗体免疫分析（图5）。所有患者的IgM免疫印迹检测均为阴性。4例患者在IgG免疫印迹上有明显的条带（患者1、4、7、8）；其中，3例患者免疫功能低下。作为阴性对照，本研究使用9个HCirV PCR阴性的供体样本，以及900名健康供体的血清库。这些样本在免疫印迹中均未显示出条带，表明其具有合理的特异性。

HCirV细胞结合试验

图6 在肝炎患者中HCirV研究中，细胞结合试验显示HCirV VLPs与PLC/PRF/5细胞结合

为进一步研究HCirV的肝向性，本研究检测了HCirV VLPs是否能与肝癌细胞结合（PLC/PRF/5）。将与PLC/PRF/5细胞结合的HEV VLPs作为阳性对照，SARS-CoV-2核蛋白为阴性对照。结果显示，HCirV VLPs能够与PLC/PRF/5细胞结合（图6）。27/90（30%）的细胞与HCirV VLPs结合，而30/468（6.4%）的细胞与HEV VLPs结合。本研究还证实HCirV VLPs可以与另一种肝癌细胞系Hep-G2结合，但没有观察到与肺上皮细胞系A549结合。

小结

在本研究中，对部分基因组测序的PCR阳性的病例定义，在1.7%的筛查者中发现HCirV感染。一些高Ct值而没有可识别序列的人可能真正感染HCirV，在这种情况下，队列中HCirV感染的流行率甚至更高。证实HCirV感染与肝炎之间的联系并不简单。患者2为传染性单核细胞增多症样综合征，其临床表现与急性病毒性疾病相似。大多数感染性单核苷酸样综合征是由原发性/急性EBV、CMV、HIV和人类疱疹病毒6感染引起的。因此，患者2的感染性单核细胞增多症样综合征可归因于HCirV。

本研究中证实HCirV可引起持续感染。尽管持续存在病毒血症，但肝功能仍可恢复正常。由于本研究中发现的HCirV患者有一半的免疫功能低下，进而推测HCirV可能在免疫抑制过程中建立潜伏期并重新激活。另一种可能性是，这些患者通过受污染的血液或器官移植感染HCirV。

本研究的局限性包括：（1）无法在3个HCirV PCR阳性样本中识别出序列；（2）由于没有样本，无法追踪大多数情况下的感染动力学；（3）由于肝炎的轻微性质，大多数病例不能进行肝活检。患者5和8只有小的核心组织活检。虽然不确定，但本研究的发现支持进一步研究HCirV作为一部分感染人类宿主肝炎的肝炎原因。

参考文献：Wu S, Yip C, Situ J, Li Z, Ho S, Cai J, et al. Human Circovirus in Patients with Hepatitis, Hong Kong. Emerg Infect Dis. 2024;30(12):2521-2531. https://doi.org/10.3201/eid3012.241114