甲羟戊酸是一种重要的生物化学分子，是萜类化合物合成的关键前体。萜类化合物广泛应用于医药、能源和化工领域，例如香料生产、抗癌药物开发以及生物燃料的制备。然而，传统的化学提取和合成方式不仅成本高昂，还会对环境造成污染。因此，利用微生物细胞工厂高效合成甲羟戊酸成为一种绿色、可持续的解决方案，而酵母细胞由于其遗传工程的便利性和高效的碳代谢能力，被视为理想的生产底盘。
尽管酵母已经被广泛用于微生物合成，但高效生产甲羟戊酸仍面临多重挑战。首先是甲羟戊酸的合成依赖乙酰辅酶 A 作为关键前体，然而，乙酰辅酶 A 的生成常常受限于酵母细胞的代谢瓶颈。并且在高密度发酵过程中，柠檬酸等副产物的过量生成会分流碳代谢，降低目标产物甲羟戊酸的积累效率。
中国科学院天津工业生物技术研究所的戴宗杰团队正是瞄准这些核心问题，通过代谢通路的重编程和发酵工艺的优化，成功打破了限制甲羟戊酸生产的“天花板”，实现了历史性的产量提升，达到 101 g/L。这一成果发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry，题为“Reprograming the Carbon Metabolism of Yeast for Hyperproducing Mevalonate, a Building Precursor of the Terpenoid Backbone”。戴宗杰研究员主要从事 Crabtree 阴性酵母合成进化生物学研究。利用理性设计与基因组编辑进化，结合系统生物学解析，阐明酵母底盘细胞生理代谢特性的分子基础，以设计-构建-测试-学习(DBTL)的方式循环迭代提升酵母底盘的代谢效能，构筑高效化学品细胞工厂。
研究团队首先聚焦于甲羟戊酸合成通路中的两个关键酶基因：ERG12（甲羟戊酸激酶）和HMGR（HMG-CoA 还原酶）。ERG12 负责催化甲羟戊酸的磷酸化，是通路的下游关键步骤；HMGR 则是通路的速率限制酶，其活性直接决定了通路整体的代谢效率。为了提升这两个基因的表达水平，研究人员在解脂耶氏酵母基因组中增加 ERG12 和 HMGR 基因的拷贝数，从而增强关键酶的催化能力。这种方法相当于为酵母代谢通路装上“双引擎”，让甲羟戊酸的合成速度显著提升。
实验结果显示，双拷贝策略使甲羟戊酸的产量从基础水平提高至4.16 g/L。并且通路的增强并未对酵母细胞的正常生长造成明显影响，表明这种策略在保证细胞代谢平衡的同时显著提高了目标产物的累积效率。
图 | 解脂耶氏酵母中甲羟戊酸生物合成的代谢途径。（来源：上述论文）
尽管通路优化已取得显著进展，但甲羟戊酸的进一步合成仍受到乙酰辅酶 A 供应不足的限制。作为甲羟戊酸的直接前体，乙酰辅酶 A 的生成依赖于三羧酸循环（TCA 循环）。然而，酵母细胞往往会通过柠檬酸分流导致碳资源的浪费，从而限制乙酰辅酶 A 的有效供应。
针对这一问题，研究团队设计了碳代谢重编程策略，通过以下步骤提高乙酰辅酶 A 的供应能力，一是引入异源 ATP-柠檬酸裂解酶，研究人员从真菌 Aspergillus nidulans 中引入一种高效的 ATP-柠檬酸裂解酶。这种酶能够将积累的柠檬酸快速分解为乙酰辅酶 A 和草酰乙酸，从而显著提高乙酰辅酶 A 的可用性。实验表明，这一策略使甲羟戊酸的产量进一步提升至接近5 g/L；二是干扰 TCA 循环，减少柠檬酸积累，为了减少柠檬酸的生成，研究团队敲除了 TCA 循环中的两个关键基因 IDH1 和 IDH2（编码异柠檬酸脱氢酶）。这些基因的敲除有效降低了柠檬酸的生成量，同时将更多的碳通量导向乙酰辅酶 A 合成。通过这些代谢重编程措施，酵母的乙酰辅酶 A 供应能力得到显著提升，为甲羟戊酸的高效生产奠定了基础。
图 | 通过修改柠檬酸途径和 TCA 循环改善乙酰辅酶 A 供应的示意图。（来源：上述论文）
柠檬酸的溢出现象通常指的是在生物合成过程中，当柠檬酸合成途径的中间产物积累到一定程度时，这些中间产物会从细胞内部“溢出”到细胞外部的现象。柠檬酸的过量生成不仅浪费了碳资源，还可能对细胞的代谢过程产生抑制作用。为了解决这一问题，研究团队进一步优化了酵母细胞的碳代谢网络，通过基因编辑技术，敲除了CEX1基因（参与柠檬酸的运输过程）。该基因的敲除相当于关闭了细胞“排放废物”的通道，直接减少了柠檬酸的溢出量。实验结果显示，敲除 CEX1 后，柠檬酸的排放量从 57.8 g/L 下降到仅 3.4 g/L，减少了 90% 以上。同时，甲羟戊酸的产量飙升至 101 g/L，刷新了现有酵母系统生产甲羟戊酸的最高记录。
通过碳代谢重编程与多层优化策略，天津工业生物所戴宗杰及研究团队为甲羟戊酸的高效生产开辟了全新路径。这不仅为萜类化合物的绿色合成提供了先进技术，也为未来代谢工程的发展指明了方向。
1.Ge Zhang, Yurui Ma, Meina Huang,et al. Reprograming the Carbon Metabolism of Yeast for Hyperproducing Mevalonate, a Building Precursor of the Terpenoid Backbone[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry ,DOI: 10.1021/acs.jafc.4c09874
2.Su L, Liu P, Liu W, et al. Computational Design-Enabled Divergent Modification of Monoterpene Synthases for Terpenoid Hyperproduction[J]. ACS Catalysis, 2024, 14: 17699-17715.
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