多巴黄素是一种天然的黄色色素，隶属于甜菜色素家族。它不仅能够为食品和饮料带来绚丽的色彩，还因其卓越的抗氧化性能，被视为健康饮食领域的“明星分子”。这类色素的天然来源主要是少量植物，例如某些仙人掌科植物。然而，自然界中的植物含有极低水平的多巴黄素，需要大量的植物才能提取出少量色素。并且，伴随着时间的高成本，还对土地和水资源造成了极大的浪费。
中科院天津工业生物技术研究所王钦宏研究团队在这种困境中找到了一条新路：通过合成生物学手段，使用改造的大肠杆菌来生产多巴黄素。这种方法不仅摆脱了对植物提取的依赖，还能显著降低生产成本和环境压力。他们近期的研究显示，通过关键酶的优化和生产路径的革新，科学家们将多巴黄素的产量提升了 286 倍。这项成果发表在Microbial Cell Factories期刊，题为“High-efficiency production of plant-derived pigment dopaxanthin in Escherichia coli by combination engineering”。
大肠杆菌是微生物合成平台的明星菌株，要让改造后的大肠杆菌成为“多巴黄素工厂”，研究团队需要从头建立一条高效的合成路径。他们的首先构建了左旋多巴（L-DOPA） 高产菌株。L-DOPA 是合成多巴黄素的关键前体。通过表达莽草酸脱氢酶 (AroE)、解除酪氨酸对 TyrA 的反馈抑制、删除 hpaD 基因这四步，最终构建了能够高效合成 L-DOPA 的菌株 T003，这也是后续改造菌株的基础，其 L-DOPA 产量达到 60.0 g/L，这是该领域的重要突破。
合成多巴黄素的下一步需要一种关键酶——DOPA-4,5-双加氧酶（DODA），它能够将 L-DOPA 转化为不稳定的中间产物，再进一步生成多巴黄素。研究团队从自然界 25 种 DODA 酶中筛选出来源于草菇（Volvariella volvacea）的 DODA表现出最高的催化活性。
然而，野生型DODA效率仍不够，于是研究团队利用易错 PCR技术对 Vvdoda 基因进行突变，构建突变文库，并将其转化到 L-DOPA 生产菌株 TLYB1 中。在第一轮筛选中，获得突变株 39F6，其多巴黄素产量比对照组 TLYB1 提高了 11.64%。通过测序分析发现 39F6 携带有两个错义突变和一个同义突变：D68V、I103V 和 L104，并实验验证单个突变的影响，发现I103V 突变有利于多巴黄素的合成，而 D68V 突变则不利于多巴黄素的合成。
第二轮筛选对 D68 和 I103 位点进行饱和突变，并比较不同突变菌株的多巴黄素产量。在第二轮筛选中，获得突变株 47D4，其多巴黄素产量比对照组 TLYB1 提高了 18.62%。通过测序分析，发现 47D4 携带有 D68V 和 R114A 两个突变。
接着开始第三轮筛选，将突变基因整合到基因组中，构建重组表达菌株: 将 VvDODAI103V 和 VvDODAI103V/R114A基因插入到 TLYB1 菌株的 YgiD（大肠杆菌自身编码 DODA 酶）位点，构建了基因组表达菌株 TLYB5 和 TLYB6。比较这两种菌株产量发现，TLYB6 的多巴黄素产量比 TLYB4 提高了 64.08%。纯化 VvDODA 及其突变体后，比较不同酶的最适 pH、最适温度、米氏常数和最大反应速率等参数，发现 VvDODAI103V 和VvDODAI103V/R114A 的催化效率比野生型 VvDODA 提高了4.16 倍和34倍，实现了多巴黄素产量的显著提升。
图 | VvDODA、VvDODAI103V和VvDODAI103V/R114A的电泳分析和酶活性分析（来源：上述论文）
分析菌株 TLYB6 的发酵结果，发现多巴黄素的产量在发酵前期较低，随后逐渐升高，最终达到 21.31 g/L。发酵液中仍存在大量的 L-DOPA，表明 L-DOPA 的转化效率仍有提升空间。
为了进一步提高VvDODAI103V/R114A 的表达水平，研究团队将 VvDODAI103V/R114A 基因插入到 TLYB6 菌株的 ldhA 和 pflB 位点，分别构建了双拷贝表达菌株 TLYB7 和三拷贝表达菌株 TLYB8。通过 qRT-PCR 分析，发现 TLYB7 和 TLYB8 中 VvDODAI103V/R114A 的表达水平比 TLYB6 提高了 2.00 倍和 2.83 倍。通过发酵曲线分析，发现 TLYB7 和 TLYB8 的多巴黄素产量均高于 TLYB6，但 TLYB8 的产量在发酵后期略有下降。通过 HPLC 分析发酵液中的代谢物，发现 TLYB7 和 TLYB8 中 L-DOPA 的积累量比 TLYB6 减少明显，表明VvDODAI103V/R114A 的表达水平越高，L-DOPA 的转化效率越高。研究团队综合考虑了多巴黄素产量和代谢负担，最终确定双拷贝表达菌株 TLYB7 为最佳菌株。在 5 L 生物反应器中进行放大发酵，以葡萄糖为底物，菌株TLYB7 能够合成 22.87 g/L 的多巴黄素，产量比以往报道提高了 286 倍
图 | TLYB4、TLYB6、TLYB7 和 TLYB8 的合成途径和放大发酵情况（来源：上述论文）
这项研究不仅证明了合成生物学在工业色素生产中的潜力，还为生物化学基础研究提供了新的视角，这一技术突破为天然色素的绿色生产打开了新篇章。通过减少对植物提取的依赖，这种方法显著降低了资源消耗和环境污染。
在未来，这种模式有望应用于更多天然化学品的生产，推动食品、医药、化妆品等多个行业向更可持续的方向发展。同时，这一研究成果还展现了科学与工业合作的巨大潜力，为全球可持续发展的目标贡献了一份力量。总之，这项研究不仅标志着多巴黄素工业化生产的一个新起点，也为未来更多天然色素和化学品的绿色生产提供了范例。
1.Jiang X, Tian L, Chen W, et al. High-efficiency production of plant-derived pigment dopaxanthin in Escherichia coli by combination engineering[J]. Microbial Cell Factories, 2024, 23(1): 1-14.
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