本文系统梳理了髓母细胞瘤分子分型的主要技术方法，涵盖各层级策略，详细对比了各项技术的原理、准确性、敏感性与特异性、适用场景、样本要求、成本及操作门槛，并重点分析了各方法在区分亚型的优势与局限。同时，文章结合临床实践现状，指出了目前的共性挑战。
分子分型是该疾病最重要的预后因素
髓母细胞瘤是一种胚胎性肿瘤，是全球儿童中第二常见的肿瘤。它的特征是肿瘤内和肿瘤间高度异质性。目前，世界卫生组织认可四个主要分子亚型（WNT型、SHH型、G3型和G4型），这些亚型赋予患者不同的临床和预后特征。在不同人群中，已经证明分子亚型与存活概率存在关联：WNT型预后最佳，其次是预后中等的SHH型和G4型，G3型预后最差。而组织学分类不同，仅有一种组织学类型（间变性大细胞髓母细胞瘤）与患者不良预后相关，但该类型仅占所有肿瘤的5%-10%。
目前，髓母细胞瘤的分型采用综合方式，涵盖每位患者的临床、组织学和分子特征。这是最佳的风险分层工具，也是为每位患者选择理想治疗方案的最佳方法。因此，多项临床试验已采用这种方法，纳入新的化疗、放疗和免疫治疗方案，旨在实施能提升每位患者治疗方案的有效性和安全性。
因此，分子分型的鉴定已成为髓母细胞瘤临床诊疗的关键环节。一旦分子亚型分类错误会导致治疗失败，即采用强度过高或过低的放疗和/或化疗方案，将直接影响患者的生活质量和预期寿命（图1）。
低准确度的分子分型方法
患者的诊断流程始于临床评估和影像学检查（如CT和MRI），随后进行安全范围内的肿瘤最大切除术。病理医生随后对切除组织进行研究以明确诊断，通过分子分类进行风险分层，最终制定治疗决策。
基于影像组学特征的分子分型：在术前阶段，多个研究团队基于影像学特征，开发了初步的分子分类方法，如根据肿瘤位置、造影剂增强情况、水肿、出血或转移这些与分子分型相关的特征进行分类。尽管与最终活检结果相比，其敏感性较低（60%-70%）。
基于免疫组化的分子分型：肿瘤常规切除后，会置于甲醛中固定，随后包埋于石蜡进行组织病理学研究，这是经典病理学的核心环节。免疫组化是髓母细胞瘤分类中最常用的技术之一，通过该方法可识别SHH型和WNT型髓母细胞瘤，但主要局限性在于无法区分G3型和G4型，并就此将其归为单一亚型（非WNT/非SHH型）。
尽管免疫组化分型具有技术和经济可及性的特点，但也存在方法学局限性，如不同品牌和批次抗体的变异性、基于组织固定和包埋方法的机构间差异，以及观察者内和观察者间的可重复性，这些因素直接影响检测的准确性。例如，多项研究对核β-catenin阳性的临界值设定不同（肿瘤区域的1%-50%），这可能导致WNT型髓母细胞瘤的鉴定出现分歧。同时，也存在其他类型肿瘤被错误鉴定为髓母细胞瘤的情况。
基于突变谱的分子分型：通过基因组、外显子组或靶向测序分析突变谱，是鉴定WNT型和SHH型肿瘤的另一种实用方法。90%以上的WNT型髓母细胞瘤因为存在CTNNB1突变而通过这种方法被检测出来，而半数SHH型肿瘤存在该通路效应蛋白编码基因（如PTCH1、SUFU和SMO）的突变，因此可通过这种方法识别。然而，该方法不适用于G3型和G4型肿瘤的识别，因为尚未鉴定出具有足够敏感性（<15%）的突变可用于界定这两个分子亚型。
基于表达谱的分子分型方法
能够以基于肿瘤表达特征区分四个分子亚型的方法，这些表达模式通过两种技术进行定量：无扩增杂交系统（NanoString）和聚合酶链反应（PCR）。
NanoString技术：基于髓母细胞瘤的组学研究，多个研究团队致力于简化四个分子亚型的特征基因集，其中Northcott等人的研究尤为突出，他们定义了包含25个基因的检测组合用于分子分类。该基因组合通过NanoString nCounter平台进行检测，该平台基于生物样本与芯片中荧光标记探针的杂交进行多重检测，无需扩增步骤。荧光信号与检测组合中标志物的表达相关，为每个分子亚型生成特异性表达谱。与大规模分析分类方法相比，NanoString可在90%-98%的患者中鉴定出分子亚型。影响准确度的因素包括：分析冷冻组织提取的RNA时，一致性可达98%；而分析石蜡包埋组织提取的RNA时，一致性降至67%-87%，且与石蜡包埋样本的存放时间相关。
定量PCR：2020年Cruzeiro等通过Taqman探针阵列和相对定量聚合酶链式反应（RT-PCRq），对同一基因组合进行了评估。该策略与大规模分析结果的一致性达97%，其中G3型髓母细胞瘤的准确度最低（88.9%）。为降低因使用多种探针的检测组合成本，他们将基因数量限制为6个，将肿瘤分为三类：WNT型、SHH型和G3/G4型（非WNT/非SHH型）。所有WNT型病例和86%的SHH型病例获得一致性结果。方法学上，qPCR检测组合的部分缺点包括：需进行多次分析才能确定单个样本的分子亚型，实用性欠佳；此外，还需要高质量、足量的样本（肿瘤RNA）以满足所有检测需求。
基于表观遗传的分子分型方法
敏感性和特异性最高的方法是转录组或表观基因组水平的大规模分析，这两种方法均被视为参考标准，应用于临床实践和研究方案中。它们的共同优势在于，部分方法已用于大规模队列分类，这有助于结果的生物信息学分析，进而促进其在新医疗中心的应用。
基于表观遗传变化的分子分型：用于髓母细胞瘤表观遗传分析的两种技术为微阵列和基因组测序。技术层面，通过甲基化谱界定分子亚型的主要优势在于样本特性：与RNA相比，DNA更稳定。此外，核酸的可及性也是一个优势：DNA可从石蜡包埋组织中获取，而活检组织石蜡包埋是临床诊断的常规步骤；相比之下，获取高质量RNA需要从新鲜组织中提取，但手术获得的组织通常立即存放在甲醛中，这会影响RNA的完整性，因此新鲜组织往往难以获取。
1.甲基化微阵列：甲基化微阵列分类通过亚硫酸氢盐处理样本与针对特定甲基化易感基因组位点（包括CpG岛、基因体、基因间区域和启动子）设计的探针杂交，检测甲基化DNA区域。
髓母细胞瘤研究中使用了三种Illumina平台：GoldenGate Cancer Panel I、450K/EPIC Human Infinium和850K/EPIC Human Infinium芯片，分别可检测超过1505个、45万个和85万个甲基化位点。在这些平台中，450K芯片应用最广泛，可对95%-100%的受检患者进行分子亚型划分。2%-4%的患者因样本量不足无法进行分析。
对比表达微阵列分类和甲基化表达结果发现，所有WNT型和SHH型病例均具有两者的相关性。然而，G3型和G4型中5%的病例存在假阳性。导致结果不一致的因素可能如Williamson在2022年所描述，包括：两者分子相似性较高，或它们属于两个分型之间的中间分子谱系。为解决这一差异，结合其他临床特征（年龄和性别）和生物学特征（组织学类型和基因改变）进行补充分析可能有助于明确分子类型。例如，大细胞组织学特征和MYC扩增在G3型髓母细胞瘤中占主导地位，但在G4型中罕见；反之，MYCN扩增在G4型髓母细胞瘤中比G3型更常见。
与其他分类方法相比，甲基化微阵列最显著的优势在于能够区分其他类型肿瘤，如室管膜瘤、胶质母细胞瘤或星形细胞瘤，这些肿瘤在组织病理学上可能被错误诊断为髓母细胞瘤，此类情况占患者的比例高达8%。因此，部分作者将该方法称为组织学谱系划分的金标准。该方法的局限性包括：最常用的平台（Illumina，Infinium）需至少同时处理8个样本，这增加了单个样本的分析成本，或导致为收集足够样本以填满芯片而延迟检测，进而阻碍患者的及时分子诊断和个性化治疗。
2.DNA测序：获取甲基化谱的另一种策略是基因组测序。髓母细胞瘤研究中使用了两种平台：Illumina和近期的牛津纳米孔技术（ONT）。与甲基化微阵列类似，Illumina测序需对肿瘤DNA样本进行亚硫酸氢钠预处理，以区分甲基化碱基。而ONT技术无需预先处理，可直接进行DNA测序，消除了亚硫酸氢盐转化导致的降解风险和Illumina文库构建中扩增带来的偏倚。
除甲基化组外，ONT平台还可用于研究其他基因组数据，如小插入缺失（indels）、结构变异、融合基因、单核苷酸变异（SNVs）和拷贝数变异（CNVs）。后两种改变与MYC扩增检测和TP53突变鉴定相关，分别是高危G3型髓母细胞瘤和SHH型髓母细胞瘤患者的特征。该技术的另一个优势是能够通过自适应采样对特定基因组区域进行实时测序，从而无需在文库制备过程中进行额外的富集步骤。这种方法可快速生成分子分类结果，通常在测序后数小时内即可获得，且与甲基化微阵列结果的一致性>90%。
甲基化组测序分类可在高达98%的患者中鉴定出分子亚型，G3型和G4型之间的误判率仅为5%。由于这是一种较新的方法，仅在小规模髓母细胞瘤患者队列中得到验证，且分析方法基于学习模型，其结果可能受样本量影响。分类模型的准确度依赖于训练所用的参考数据，因此需考虑数据集中的样本数量以及分类所涉及的类别（分子分型）数量和命名。这些局限性可通过数据共享和类别标准化的协作过程来弥补。此外，由于髓母细胞瘤固有的异质性，全球人群中很可能会持续鉴定出具有中间表型的病例，导致分子分型划分存在分歧。
3.最小甲基化分类器：基于甲基化模式分类的另一种工具是鉴定包含17个甲基化区域（CpG位点）的甲基化组特征，称为MIMIC（Minimal Methylation Classifier）。该方法的设计基于450K/EPIC Human Infinium微阵列数据，提取四个分子亚型中甲基化变异性最大的区域，并通过Agena iPLEX技术（基于PCR和质谱）进行分析。
DNA样本需预先进行亚硫酸氢盐处理以区分甲基化胞嘧啶，目标区域通过PCR扩增后进行单核苷酸延伸——甲基化区域（保留胞嘧啶）会掺入鸟嘌呤核苷酸，而非甲基化区域（转化为尿嘧啶）会掺入胸腺嘧啶核苷酸。最后，通过质谱分析扩增产物，根据分子量确定甲基化状态。该方法的准确度为92%-98%，但由于质谱平台成本较高，尚未在医疗中心广泛应用。
基于转录组的分子分型方法
髓母细胞瘤的转录组分析首次揭示了这四个分子亚型的存在。因此，2011年Northcott发表研究，确立了髓母细胞瘤的分子共识，每个亚型均根据其表达特征命名，缺乏特异性通路的G3型和G4型除外。表达微阵列分子分类因其高敏感性和特异性，成为首选策略之一。
表达数据微阵列：髓母细胞瘤四个分子亚型存在的首个证据来自通过HumanGene U133微阵列平台（A版和U133 Plus 2.0版）进行的表达谱分析。随后，其他微阵列如Human Exon 1.0、Human Gene 1.1 ST、Human Gene 2.0 ST和Whole Human Genome 4×44 K）也被用于相关研究。这些平台在阵列密度、识别的转录本数量和区域方面存在差异：例如，Human Gene 2.0 ST芯片包含135万个探针，可识别41.8万个外显子和4.8万个mRNA 3'区域标志物；而Human Exon 1.0阵列包含约550万个探针，分布在超过100万个外显子中，涵盖2009年记录的所有转录本。
然而，无论使用何种阵列类型和结果解读的生物信息学分析方法（主成分分析、非负矩阵分解或层次聚类），所有患者均可被分类，即无模糊病例。因此，该方法被视为髓母细胞瘤分子分类的金标准，准确度达100%。全球最大规模的队列均通过该方法进行分类，这为其在新中心的应用提供了优势，有助于分析模型的训练和验证。
同样，大规模分析需考虑的方面包括技术要求和基础设施，这是关键因素。微阵列分类至少需要三种高度专业化的设备：杂交炉、流体工作站和扫描仪。此外，样本处理的技术复杂性需要训练有素的人员以维持整个过程中样本的完整性，同时需要具备专业培训的人员进行结果的生物信息学分析。这对其在临床实践中的应用构成了挑战。
小结
本综述旨在为不同资源条件的医疗中心提供分子分型技术选择的参考依据，帮助其在可及范围内选用适宜的诊断工具。同时，通过系统评估现有方法的一致性、可重复性与误判风险，呼吁建立多中心标准化的检测流程与质控体系，并推动低成本、高精度新型技术的研发与临床转化，以期提升髓母细胞瘤全球范围内的精准诊疗水平。
参考文献：Ramírez-Chiquito JC, Juárez-Méndez S. Strategies for the molecular classification of medulloblastoma.Biomedicines, 2025, 13(12): 2845. DOI:10.3390/biomedicines13122845.
敬请注意：本文仅供相关专业人员学习参考之用，文中的所有信息均不作为诊断和治疗疾病的依据。如出现文中描述的症状，请及时就医。另外，本文仅节选原文的一部分，内容可能不完整或与原文存在偏差，若需更完整的信息请参阅原文。
热门跟贴