在 Western Blot 的日常流程里，β-actin、GAPDH、α-Tubulin 几乎是研究者默认选择的上样对照。但在投稿环节，这种「默认」正在失效：多本主流期刊已将「内参必须经过稳定性验证」写入作者指南或方法学社论，未提供验证证据的归一化结果，正越来越频繁地在审稿阶段被直接质疑。对作者而言，这已不再是格式问题，而是可能触发补充实验要求的实质性审稿意见。（点击此处申请免费试用）
一
六本期刊，同一条底线
以下为六本期刊作者指南与方法学社论的原文截图，高亮部分为原始标注。
图 1｜期刊原文：内参必须验证（一）
图 2｜期刊原文：内参必须验证（二）
梳理 Journal of Biological Chemistry、Nature Communications、British Journal of Pharmacology、Acta Pharmacologica Sinica、JBMR Plus 与 Drug Metabolism and Disposition 的公开要求，可以归纳出三点高度一致的共识：
第一，举证责任在作者一方。BJP 要求作者主动说明所选对照为何最合适，并提供支持性证据；JBC 的表述更为直接——在没有证据表明实验处理不影响内参表达之前，不应使用内参进行归一化。
第二，稳定性必须在本研究的实验条件下成立。Nature Communications 与 Acta Pharmacologica Sinica 均强调「所研究的实验条件」这一限定，这意味着引用其他体系、其他处理方式下的文献结论，并不足以免除本研究的验证义务。
第三，总蛋白归一化被普遍列为推荐方案。JBC 建议尽可能采用总蛋白归一化；JBMR Plus 将总蛋白与「表达不受实验条件影响的内参」并列为可选方案；DMD 则要求在选择内参路线时，一并报告实验条件对内参本身的影响。
二
内参为什么会失效
期刊的谨慎并非形式主义，而是有明确的方法学依据支撑。内参失效主要来自两条相互独立的路径。
图 3｜内参失效的两种机制
其一是表达水平的生物学漂移。早在 1983 年即有研究发现，actin 的 mRNA 水平会随细胞形态与贴壁状态发生改变；Dittmer 与 Dittmer 在 Electrophoresis（2006）中直接指出， β-actin 并非可靠的上样对照；Eaton 等在 PLoS ONE（2013）中系统比较多种神经退行性模型组织后发现，actin、tubulin 等常用参照蛋白存在明显的差异表达。一旦内参与目标蛋白同向变化，归一化后的比值会掩盖真实差异，形成假阴性；若两者反向变化，则会人为放大效应量。
其二是线性范围与信号饱和。内参大多为高丰度蛋白，而研究者关注的目标蛋白通常丰度较低。当上样量满足目标蛋白检出需求时，内参信号往往已进入平台期。Aldridge 等在 Journal of Neuroscience Methods（2008）中证明，在常规定量所用的上样浓度下，GAPDH 与 β-actin 的信号已无法准确反映蛋白量的差异。值得注意的是，处于饱和状态下的内参条带反而显得格外「整齐」——这并非上样均一的证据，而是信号已失去分辨能力的表现。
这两条机制共同导致一个后果：内参条带本身无法自证其有效性。它既可能因表达改变而失真，也可能因信号饱和而失真，而这两种情形在图像上往往都不会留下明显痕迹。这正是多本期刊要求由作者主动提供验证数据，而不是交由审稿人事后推断的原因。
三
投稿前的内参自查清单
基于上述要求与机制，投稿前的内参核查可以归纳为五个可执行的动作。这五条并非某一本期刊的特殊规定，而是前述六本期刊要求的交集，其中任何一条缺失，都可能在审稿阶段被要求补充实验。更稳妥的做法是在实验设计阶段就纳入考虑，而不是等到数据成图之后再回头补做——后者通常意味着重新制备样品并重复整轮电泳与转膜。
图 4｜投稿前的内参自查清单
四
更稳妥的路径：总蛋白归一化
总蛋白归一化以泳道内全部蛋白的信号作为上样参照，不依赖「某个单一蛋白表达恒定」这一前提，因而从原理上规避了第一条风险。同时，总蛋白检测的灵敏度低于抗体免疫检测，在 10～50 µg 的常规上样区间内不易饱和，线性范围更宽。Gilda 与 Gomes 在 Analytical Biochemistry（2013）中的对比研究显示，以 Stain-Free 总蛋白染色作为上样对照，其表现优于 β-actin。此外，转膜后的总蛋白成像还能反映各泳道的转膜均一性，这是单一内参条带无法提供的信息。
Bio-Rad 的 Stain-Free 技术在凝胶中预置三卤化合物，经紫外活化后与蛋白质的色氨酸残基发生共价结合并产生荧光信号，可在电泳后与转膜后分别成像，从而在同一流程内同时获得上样量与转膜效率的证据，无需额外的染色与脱色步骤。需要说明的是，该方法依赖色氨酸残基，对色氨酸含量极低的蛋白样品，其灵敏度会受到限制，实验设计时应予以考虑。
从内参验证到总蛋白归一化，方法学上的转变往往意味着实验流程需要重新摸索。为了帮助科研人员减少因内参选择和归一化方式不当造成的重复实验，我们准备了Stain-Free 免染 WB 实验流程免费试用；如果您对多色荧光 WB 实验同样感兴趣，也可一并申请试用。
注：
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结语
把内参当作「默认选项」的时代已经过去。无论最终选择继续使用内参，还是转向总蛋白归一化，期刊要的都是同一件事——证据。
内容策划：沈佳钰
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
参考文献
[1]. JBC, Collecting and Presenting Data（作者指南）
[2]. Nature Communications, Guidance on the Analysis and Presentation of Western Blots
[3]. Br J Pharmacol, 2018, 175: 407–411
[4]. Acta Pharmacol Sin, 2021, 42: 1–3（Western blotting 良好实践社论）
[5]. JBMR Plus, Immunoblots（作者指南）；Drug Metabolism and Disposition, Guide for Authors
[6]. Dittmer A & Dittmer J. Electrophoresis, 2006, 27: 2844–2845
[7]. Aldridge GM et al. J Neurosci Methods, 2008, 172: 250–254
[8]. Eaton SL et al. PLoS ONE, 2013, 8(8): e72457
[9]. Gilda JE & Gomes AV. Anal Biochem, 2013, 440: 186–188
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