介绍

CD19靶向嵌合抗原受体为肿瘤学和其他医学领域的新型免疫疗法开辟了道路。这种治疗创新基于基因工程、肿瘤免疫学和细胞制造科学的进步。其基本原理在于通过基因指示T细胞识别任何选定的抗原，从而绕过库限制和免疫耐受的限制，并通过向患者提供有效的人造免疫细胞来加速免疫的建立，而不是诱导不确定的内源性反应通过主动免疫。

CD19是一种在大多数B细胞恶性肿瘤中发现的细胞表面分子，我们最初选择它作为CAR靶点而不是其他B细胞表面分子，如CD20和CD22，因为它的表达相对较高。基于CD19特异性CAR可以消除小鼠白血病和淋巴瘤的证明 。美国国家癌症研究所和宾夕法尼亚大学对难治性/复发性 CD19+ 恶性肿瘤患者进行了临床试验。在 NHL、CLL 和 ALL中获得的早期轶事结果很快在更大的单中心和多中心研究中得到证实 。

2017年美国食品药品监督管理局和2018年欧洲医药管理局批准的首批 CAR是针对CD19的第二代CAR。这些 CAR 分子包含CD28或 4-1BB共刺激域（图 1A）。迄今为止，多种 CAR产品已获批（Tisagenlecleucel、Axicabtagene ciloleucel、Brexucabtagene autoleucel、Lisocabtagene maraleucel）等，用于复发性或难治性 (r/r) 儿童和年轻成人 B 细胞急性淋巴细胞白血病、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤、高B 细胞淋巴瘤、原发性纵隔大 B 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和某些滤泡性淋巴瘤。一些出色的临床评论涉及 CD19 CAR T 细胞在不同疾病环境中的功效及其毒性，包括 B 细胞发育不全、细胞因子释放综合征 (CRS) 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)。

图1 CAR结构、功能和设计。(A) 原型CD19 CAR。(B) 新颖的28z CAR设计。左图：1928z CAR T 细胞在膜近端位置 (1XX CAR) 具有单一功能性 ITAM，显示出增加的持久性，同时保留了强大的效应器功能。右图：包含截短的细胞质IL2Rb和 YXXQ STAT3结合基序（28-ΔIL2RB-z(YXXQ) CAR）的 CAR 能够实现抗原诱导的 JAK-STAT 激活。(C) 新颖的BBz CAR 设计。左图：在基于4-1BB 的CAR (BBzz CAR) 中将 ITAM 从 3 增加到 6 可增强抗原敏感性和 IL2 分泌。右图：在基于 4-1BB 的 CAR（BBz(86) CAR）中改变细胞外和细胞内结构域的长度会降低细胞因子的分泌和 CRS 的严重程度。

CD19 CAR 疗法的成功引发了人们对这种新型免疫疗法的广泛兴趣。目前，clinicaltrials.gov上列出了700多项临床试验，其中41%的目标是 CD19，其余的要么是血液系统恶性肿瘤（32%），要么是实体瘤（27%）（图 2A）。CD22和CD20已被证明是B细胞恶性肿瘤的有效CAR靶点，尽管程度低于CD19，而BCMA显示出治疗多发性骨髓瘤的巨大希望，BCMA CAR T细胞由FDA已批准。本综述讨论了在肿瘤学及其他领域实施 CAR 治疗所面临的下一个前沿和挑战。

图2 针对 CAR T 细胞的临床试验总结。(A) 针对CD19、其他血液学和实体恶性肿瘤的临床试验。根据clinicaltrial.gov（2021年3月）：全球41% 的临床试验使用CD19 CAR T 细胞。这包括 CD19 和 CD22 CAR T 细胞治疗的双重靶向。共有 32% 的临床试验针对血液癌症，但不针对 CD19。共有 27% 的临床试验针对实体瘤。(B) 血液学和实体瘤临床研究中的 CAR 靶点。基于clinicaltrial.gov（2021 年3 月）：分析临床试验中用于指导CAR T 细胞的感兴趣抗原的分布，表明抗CD19 scFv 是使用的主要CAR T（37%），其次是抗BCMA scFv (9%)。其他针对其他血液学或非血液学抗原的 CAR T 细胞落后于所有 CAR T 临床试验的不到 4%。(C) 为 CAR 疗法设计的细胞类型。基于clinicaltrial.gov（2021年3月）：大多数CAR T 细胞是使用αβ T 细胞（> 96%）转导的。其他细胞类型正在开始研究，占列出的临床试验的 4%。这些细胞包括：γδ T 细胞、NK 和 NK/T 细胞、多能干细胞衍生的免疫细胞和单核细胞。

CAR设计的演变

目前的CAR包含一个用于抗原识别的单链Fv (scFv) 和一个双信号尾，通常包含CD3-ζ和CD28或4-1BB细胞质结构域。适应目标分子上表位位置的不同支架可以进一步改善整体CAR功能。在某些情况下，结合域源自受体-配体对，或者可能包含VHH元件而不是scFv。这种架构是模块化的，可以适应广泛的目标（图 1A）。

CAR设计不断发展，利用亲和力优化的人类结合域并招募不同的信号通路。这种演变的一个例子是有效的28z CAR设计中激活强度的降低 ，另一个是在效力较低的BBz中增强（图 1B 和 C）。其他例子是在28z CAR中额外募集JAK/STAT信号（图 1B）或添加间隔元件以减弱BBz CAR的细胞因子分泌（图 1C）。

与天然T细胞的单一特异性相反，CAR T细胞可以通过设计多特异性 CAR或CAR共表达来结合多种抗原。靶向两个独立的抗原可能会减少肿瘤逃逸并增加对肿瘤细胞的选择压力。第一个双靶向CAR T细胞已进入临床，结合了两种针对 CD19和CD22 的BBz CAR。将28z CAR与BBz CAR相结合可提供卓越的抗原敏感性和效力，通过将信号特征与抗原密度相匹配，进一步增强了这一点。

一种变体方法需要两种不同的 CAR 成功识别两种上调的肿瘤抗原，以启动完整的免疫细胞功能，正如Eshhar的小组使用针对骨髓瘤细胞的双靶向CAR T细胞所证明的那样。结果不仅显示了有效且有效的CAR T，而且还是一种保护正常健康组织的安全策略。

CAR T细胞疗法治疗实体瘤

目前同时获得美国FDA和EMA批准的CAR T细胞针对CD19，用于治疗一些难治性白血病和淋巴瘤。使CAR疗法适应实体瘤的治疗是一个主要目标和挑战。在实体瘤试验中获得的第一个结果，以针对B细胞恶性肿瘤实施的成功策略为模型，一直乏善可陈，表明需要进一步改进和专门调整CAR治疗实体瘤。克服在B细胞恶性肿瘤中已经遇到的 CAR 治疗耐药机制可能有助于实现这一目标。

一种耐药机制是肿瘤细胞中CAR靶标的表达水平不存在或不足。多项试验的报告表明，接受CD19靶向CAR T细胞治疗的患者中，多达25%的患者复发了CD19阴性或CD19低的疾病。这种现象被称为抗原逃逸。

另一种耐药机制可以追溯到CAR T细胞由于物理障碍和/或免疫抑制性肿瘤微环境(TME)进入和浸润肿瘤的能力有限。在B细胞恶性肿瘤领域，经常注意到反应可能在BM中是完全的，但在其他疾病部位如LN或腹膜后间隙则不是。即使是浸润，也可以预期实体瘤将采用一系列机制来抑制T细胞和 CAR T细胞，包括髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和Treg。

因此，CAR T细胞成功治疗实体瘤至少需要确定合适的靶抗原，使CAR T 细胞能够进入所有肿瘤部位并克服TME的免疫抑制作用。

目标选择

解决实体瘤的首次尝试复制了在B 细胞恶性肿瘤中建立的方法，利用相同的CAR设计（28z或BBz）并靶向单一抗原。虽然在多形性胶质母细胞瘤 (GBM)、头颈部鳞状细胞癌和前列腺癌中偶尔获得了良好的反应，但总体反应无法与 CD19 CAR 疗法相提并论。

一个限制是由于缺乏潜在的靶标，如 CD19，在几乎所有肿瘤细胞的表面表达，并且仅在可有可无的正常细胞中表达。尽管很少有分化抗原符合这两个标准，但一些在肿瘤中过度表达的蛋白质虽然不是肿瘤特异性的，但显示出前景，例如间皮素、PSMA、GPC3等。

然而，如果要在特定治疗窗口内校准CAR功能以限制对正常细胞的反应，仔细选择scFv、信号成分和转录调控，则靶向正常组织中发现的肿瘤抗原可能是可能的。抗原特异性抑制剂CAR也可用于保护正常组织。图2B 说明了目前基于cilinicaltrial.gov的血液学和实体瘤临床研究中CAR靶抗原的分布。

在肿瘤细胞中经过特异性修饰的细胞表面抗原是一类有吸引力的CAR 靶标。聚糖，包括糖脂、N 和 O 连接的糖蛋白以及糖胺聚糖，可以在癌细胞中进行特定的糖基化。它们包括晚期上皮癌中的LewisY、胰腺腺癌中的 sialyl-LewisA、神经母细胞瘤和一些神经胶质瘤中的 GD2以及各种腺癌中的 Tn-MUC1。多种酶参与聚糖生物合成及其冗余是它们稳定表达的原因，并可能降低抗原逃逸的风险。肿瘤细胞确实必须失去有助于 O-糖基化的 >20个GalNAc多肽转移酶中的几个才能停止产生Tn抗原。然而，如果蛋白质骨架发生突变（例如 Tn-MUC1 的 MUC1 丢失），糖蛋白表达可能仍会丢失。

肿瘤浸润

与任何T细胞一样，CAR T细胞需要外渗到肿瘤部位并克服TME中的免疫抑制才能有效（图 3）。向外周组织转运的免疫细胞受复杂的信号传导和物理过程的调节，这些过程可能在某些肿瘤中被显着破坏。免疫学“冷肿瘤”带来的挑战是所有免疫疗法的普遍障碍。

然而，T 细胞工程允许独特的解决方案。例如，在某些情况下，通过趋化因子定向迁移，例如通过在 CAR T细胞中过表达IL8受体CXCR2R（图 3A），可以缓解进入肿瘤的速率限制[62]。

另一种方法是将 CAR T细胞定向到肿瘤周围，例如，CAR T细胞可以靶向成纤维细胞相关蛋白(FAP)，该蛋白存在于TME的基质成纤维细胞中。靶向FAP的CAR T细胞可有效浸润实体瘤，但也可能具有骨髓毒性（图 3B）。另一种方法是利用分泌酶的CAR T细胞形成一条途径，例如乙酰肝素酶，以降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（图 3C）。

图3 增强CAR-T细胞疗法对实体瘤疗效的精选新策略：（A）CAR 修饰的T细胞表达趋化因子受体，以增加其运输/返回肿瘤部位（例如 CXCR2）的能力。(B) FAP 特异性CAR-T细胞可以将CAR-T细胞引导至肿瘤周围。(C) 乙酰肝素酶表达增强 CAR-T细胞在 TME 中形成路径。(D) CAR T 细胞在实体瘤中的瘤内给药。(E) 使用靶向免疫检查点抑制受体的单克隆抗体进行联合治疗以缓解免疫抑制。(F) 减少受体功能或耗竭标志物的siRNA。(G) 工程化 CAR T 细胞，可分泌促炎或 CAR-T 支持细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12 或 IL-15。(H) 提议整合多种代谢策略（例如 l-精氨酸）以优化制造过程并最大化 CAR T 细胞的治疗功效。

实体瘤中局部或区域性CAR T细胞递送不仅可以最大限度地增加CAR T 细胞在肿瘤部位的积累，而且还可以通过限制其全身分布来提高其安全性（图 3D）。以间皮瘤中的间皮素为靶点的区域CAR疗法已显示出有效且持久的CD4依赖性肿瘤免疫，与静脉给药相比，可提供更大的抗肿瘤功效。

微环境免疫抑制

肿瘤及其基质吸引并支持多种免疫抑制细胞类型，包括髓源性抑制细胞、巨噬细胞、Foxp3+ Treg、成纤维细胞和血小板的异质群体。正在研究多种作用于TME相关免疫抑制的抑制剂。通过将此类药物与CAR T细胞结合来克服TME可能被证明是有益的（图 3）。封锁强制免疫抑制的抑制性免疫检查点是一种很有前景的选择。检查点抑制可以通过将CAR T细胞与免疫检查点抑制抗体的全身给药相结合来实现或以细胞内在方式，通过消融，例如，PD-1或降低其功能与显性阴性受体。干扰RNA提供了另一种降低但不完全消除受体功能的方法，例如，沉默腺苷受体和其他耗竭标记物，如TIM-3、LAG-3、TIGIT 和 KLGR-1（图 3E）。腺苷介导的 T 细胞抑制可以通过其他方式抵消，例如使用 shRNA（图 3F）或通过将腺苷受体的细胞外结构域融合到细胞内共刺激结构域的腺苷响应CAR的A2AR基因靶向，从而转化将通常的抑制信号切换为激活信号。

可以利用CAR T细胞对TME进行重新编程。例如，CAR T细胞可以提供局部细胞因子分泌，以增强它们的浸润、增殖和持久性。表达CAR的T细胞可以被设计为产生多种细胞因子（例如IL-4、IL-2、IL-7、IL-21 和 IL-15）（图 3G）或其同源受体，旨在以提高这些细胞的抗肿瘤活性和持久性。这些CAR T细胞有时被称为装甲CAR、第四代CAR或TRUCK（重新定向的T细胞用于抗原不受限制的细胞因子启动杀伤）。例如，已被证明可以诱导性或组成性表达IL-12的TRUCK激活先天免疫抗肿瘤反应并改变肿瘤免疫抑制。

癌细胞糖酵解代谢的增强可能会限制肿瘤床中CAR T细胞可用的营养物质，阻碍其功能或存活，从而影响微环境并抑制免疫细胞。已证明使用预处理体外喂养或抑制肿瘤的特定代谢途径为CAR T提供营养物质可提高CAR T存活率，例如在过继转移之前向CAR T细胞提供 l-精氨酸（图 3H）。

CAR T细胞疗法的毒性

CAR T 细胞是强大的免疫效应器，在某些情况下可能会导致需要专家和紧急医疗管理的严重毒性。对于任何特定患者，这些急性毒性的发生仍然难以预测，并阻碍了CAR疗法的广泛实施。

第一种毒性是预料之中的，归因于CAR T细胞的靶向/非肿瘤，导致CD19 CAR的B细胞再生障碍。已经提出了不同的方法来抑制对正常细胞的毒性。一种利用具有分裂共刺激结构的第二代CAR，结合传统的激活构建体和抑制性CAR，通过确保效应细胞仅在存在确定的肿瘤相关抗原阵列时才达到完全激活，有可能实现更高的靶标精度。另一种方法结合抑制性 AR来重新训练 T细胞功能。

新型CAR T细胞的未知毒性也可以通过在RNA转染后注入瞬时表达CAR 构建体的T细胞来限制，从而最大限度地减少不可预见的毒性的持续时间 。在实体瘤的背景下，转基因 T细胞的局部递送也可以减轻毒性，同时提高疗效。

另一种降低副作用的方法是找到最小有效剂量。Globerson Levin等人对达到治疗效果所需的CAR T细胞数量进行建模，同时减少注射的 CAR T 细胞数量以减少副作用。并显示使用比目前使用的 CAR-T 淋巴细胞少得多的可能性。

其他两种毒性，在第一次 CD19 CAR 试验开始时没有预料到，迄今为止构成了更大的挑战：CRS 和 ICANS。这两种毒性都发生 CAR T细胞给药后的早期，并且可能在多达三分之一的 CAR T细胞接受者中显着。

CRS的机制开始被很好地理解 。病理性细胞因子分泌主要归因于TME 中 CAR T细胞和骨髓细胞之间的相互作用。虽然活化的T细胞产生趋化因子和细胞因子，包括IL-2、可溶性IL-2R-α、IFN-γ、IL-6、可溶性IL-6R和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，但IL6和IL1的主要来源是肿瘤附近的巨噬细胞和CAR T细胞。CRS 管理的基石是IL6R阻断剂和皮质类固醇，但新的干预措施，包括IL1Ra、达沙替尼等，正在出现。神经毒性知之甚少，主要通过皮质类固醇进行治疗。

通过自杀基因或其他消除开关的作用，可以通过可逆地关闭CAR信号传导或不可逆地消除CAR T细胞来终止 CAR T细胞活性。自杀基因可以包含在转染构建体中，在用特定药物诱导后触发细胞凋亡。

因此，虽然急性CAR T细胞毒性目前限制了CAR T细胞的广泛使用，但鉴于CAR设计的快速进展和我们对CRS病理生理学的理解，可以预期这种限制最终会被消除。

CD19 CAR T疗法为基于细胞的免疫疗法和合成免疫学打开了潘多拉魔盒。这些进步将依赖于受体和电路设计、肿瘤免疫学、基因工程和细胞制造科学的进步。过去10年 CD19 CAR T细胞取得的临床成果，促使制药行业探索和投资基于细胞的免疫疗法，这是以往过继细胞疗法所无法实现的。开发一系列个性化疗法需要大量工作，这将需要确定合适的靶标，克服TME，进入冷肿瘤，最大限度地降低毒性。

声明：本文为作者观点，不代表药精通Bio观点和立场，不构成任何投资和决策建议。本文旨在介绍医药健康研究进展，不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。欢迎投稿，投稿邮箱：marketing@all-shun.com