前沿药理：体内外肠道菌群和代谢组学分析评价小承气配方对慢传输型便秘的影响

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编译：微科盟廿九，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

小承气(XCQ) 配方是治疗肠动力不足的中药方，对慢传输型便秘(STC)患者有效。XCQ配方是在承气汤的基础上改造而成的，人们在处方中加入黄芪、当归和煮熟磨碎的丹参以增强疗效。本研究构建STC大鼠模型并用该配方治疗，以了解XCQ促进肠蠕动的详细机制。我们通过16S rDNA测序、代谢组学测定和组织RNA测序探究了XCQ配方对肠道菌群和代谢水平的影响及其调节的可能分子机制。结果显示，Roseburia spp.菌属的丰度显著下降。在STC大鼠的粪便中，丁基氨基苯(BAB)的含量显著降低，并且STC大鼠结肠中Cajal间质细胞(ICC)的数量增加。此外，体外和体内实验表明，BAB可以激活ICC表面的IL-21R，上调下游分子STAT3和ERK的磷酸化，并抑制洛哌丁胺诱导的ICC凋亡。因此，XCQ配方可以通过保护ICC活性、促进Roseburia spp.菌属定植促进蠕动、增加代谢后的BAB含量来改善STC患者的排便状态。

论文ID

原名：Effects of Xiao Chengqi Formula on Slow Transit Constipation by Assessing Gut Microbiota and Metabolomics Analysis in vitro and in vivo

译名：体内外肠道菌群和代谢组学分析评价小承气配方对慢传输型便秘的影响

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.810

发表时间：2022.05

通讯作者：黄丹丹，任东林

通讯作者单位：中山大学附属第六医院

实验设计

实验结果

1. XCQ配方的高效液相色谱(HPLC)图

XCQ配方的HPLC色谱图如图1所示，化合物的特征以保留时间(RT)和m/z表示。XCQ配方中含有多种化合物，包括XCQ配方中七种药材的主要成分，如大黄酸(RT，1.11 min；m/z，197.8074)，大黄素(RT，12.19 min；m/z，269.0456)，丹参多酚酸B (RT，5.14 min；m/z，717.1445)，阿魏酸(RT，10.33 min；m/z，283.0246)，黄芪甲苷IV (RT，9.2 min；m/z，829.4572)，黄芪甲苷II (RT，10.09 min；m/z，871.4666)，厚朴酚(RT，12.8 min；m/z，265.1231)，地黄D (RT，1 min；m/z，731.2247)，和辛弗林(RT，1.12 min；m/z，197.8074)。

图1 XCQ配方的HPLC色谱图

XCQ配方中生物活性化合物的色谱图，包括大黄酸、大黄素、丹酚酸B、阿魏酸、黄芪甲苷IV、黄芪甲苷II、厚朴酚、地黄D和辛弗林。

2. XCQ配方改善STC模型SD大鼠的排便功能

如图2A–C所示，洛哌丁胺可以使SD大鼠排便的水分含量和粪便重量显著低，而XCQ配方可以增加STC大鼠的粪便重量。我们可以观察到STC组的小肠推进率显著降低，因此我们成功建立了STC大鼠模型(图2C)。此外，XCQ配方可以改善哌啶醇诱导的转运功能障碍。

图2 XCQ配方能改善STC大鼠的排便功能

A，各组大鼠的体征包括体重增长稳定，正常对照组大鼠体重增长速度较快。通过将各组数据与对照组进行比较，我们发现STC组的粪便重量和含水量显著低于对照组，XCQ组的排便重量显著高于STC组，对照组和STC组之间的差异以绿色星号表示，对照组和XCQ组之间的差异以紫色星号表示，*p < 0.05，* * p < 0.005；B，STC组小肠推进率降低；C，各组小鼠小肠推进长度；D，三组大鼠结肠的HE染色；E，XCQ配方组肌层c-kit的表达明显高于STC组，c-kit的表达用红色箭头表示；F，STC患者结肠组织c-kit的表达变化，c-kit的表达以红色箭头标记。

3. XCQ配方改善STC模型SD大鼠c-kit的表达

HE染色显示，XCQ配方可减少STC大鼠结肠组织中炎性细胞的浸润，减轻肌层粘膜的水肿(图2D)。组织免疫荧光染色显示，XCQ配方逆转了洛哌丁胺诱导的STC大鼠结肠ICC的降低(图2E)。对照组为无梗阻史结肠肿瘤患者手术标本的全层远端结肠组织，STC组为结肠肿瘤患者的全层扩张结肠组织。组织免疫荧光染色检测了两例患者石蜡切片中c-kit的表达，表明STC组c-kit的表达普遍低于对照组。周围神经丛中c-kit表达(ICC-AP)明显降低(图2F)。

4. XCQ配方能提高STC大鼠粪便中Roseburia spp.菌属植物的丰度

为了探讨XCQ配方对STC大鼠肠道菌群的影响，我们采用16S rRNA微生物分析方法，分析了XCQ配方对洛哌丁胺诱导的STC大鼠肠道菌群系的影响。我们在上述五组中共发现2537个OTUs，其中对照组1029个，STC组1082个，XCQ组1098个。我们在对照组和STC组中均检出282个OTUs，在XCQ组中也检出304个OTUs。通过基于未加权UniFrac指数的主坐标分析(PCoA)的β多样性分析，我们发现对照组比STC组更接近XCQ，这表明XCQ和对照组在微生物群落结构上有很高的相似性(图3A)。稀释性曲线随Chao1指数的增加而变平，表明有较好的测序深度和较高的物种覆盖度。α多样性分析表明，STC组和对照组的微生物丰度没有显著差异(图3B)。我们分析了XCQ治疗对STC大鼠肠道菌群的影响。在门类的水平上，与对照组相比，STC组的放线菌门、黏胶球形菌门和变形杆菌门的丰度显著增加，而蓝细菌的丰度显著降低，试验组和STC组之间的差异不显著。同时在纲类的水平上，与对照组相比，STC组中的β-变形菌纲和ε-变形菌纲的丰度显著增加。此外，C0D-2、梭状芽胞杆菌和柔膜菌的丰度显著下降。与STC组相比，模型组梭状芽胞杆菌和柔膜菌的丰度显著增加，而γ-变形菌和RF3的丰度显著降低(图3C)。此外，Roseburia spp.菌属的相对丰度也较高；STC组也低于对照组，但经XCQ治疗后STC组Roseburia spp.菌属的相对丰度也升高(图3D)。这些结果表明，XCQ治疗可以逆转STC发病过程中肠道菌群结构的变化。

图3小承气配方对STC大鼠肠道菌群的影响

A，PCoA散点图显示三组间肠道菌群丰度存在显著差异，STC组菌群丰度显著低于对照组；B，Chao1指数显示，空白组、STC组和实验组大鼠粪便中的群落丰富度无显著差异；C，LEfSe分析表明，Roseburia spp.是三组间有显著差异的代表性菌落；D，基于目、科和种的水平，可以看出Roseburia spp.的丰度在STC组中显著降低，在XCQ处理后其丰度显著增加。

5. XCQ配方对STC大鼠粪便代谢物的影响

我们对来自对照组、STC组和XCQ组的样品进行表征和比较。我们共获得粪便样本中的1016个分子特征和血液样本中的851个分子特征，并使用MetaboAnalyst(版本3.2.0)进行统计分析。主成分分析(PCA)结果显示，XCQ会影响大鼠的代谢(图4A)。p值< 0.05且倍数变化≥2或≤0.5的特征被认为是最重要的代谢物，并可以通过热图进行可视化分析(图4B)。我们在对照组和STC组中共鉴定出93种重要代谢物，在STC组和XCQ组中共鉴定出21种重要代谢物。在差异代谢物中，STC组的N-甲基酪胺、 丁基氨基苯 (BAB)和5-脱氧-5-甲硫氨酸显著减少，而XCQ配方会显著上调这些代谢物的水平。

图4XCQ配方对XCQ大鼠代谢物的影响

A，组间成分差异的PCA分析表明，STC大鼠粪便(左)和血清(右)中的代谢物与对照组有显著差异，XCQ配方可显著影响STC大鼠的代谢；B，从代谢物热图(左图为对照组和STC组，右图为STC组和实验组)可以看出，丁基氨基苯(BAB)和5-脱氧-5-甲硫氨酸的含量在三组之间差异显著；C，两组之间的京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析用气泡图显示；D，BAB与Roseburia spp.物种丰度的关系(皮尔逊相关系数= 0.501)；E，BAB的复合结构。

为了根据粪便中的代谢组学数据确定生物学模式，我们利用KEGG代谢数据库，使用MetbraAnalyst R(3.2.0版)进行通路分析。粪便样本中受干扰的代谢途径如图4C所示。与对照组相比，STC大鼠的矿物质吸收、癌症的中心碳代谢、蛋白质消化和吸收、朊病毒病和氨基酰-tRNA生物合成显著富集。L-色氨酸、L-甲硫氨酸和色胺水平在蛋白质消化吸收和氨基酰-tRNA生物合成中增加。色胺和L-色氨酸还在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及神经活性配体-受体的相互作用途径中富集。

此外，我们还分析了代谢物与差异菌群的相关性，发现粪便代谢物BAB的含量与Roseburia spp.菌属的相对丰度呈正相关(图4D)。BAB是由4-氨基苯甲酸的羧基与丁烷-1-醇的羟基形成的氨基酸酯(图4E)。对氨基苯甲酸是某些菌群的必需营养物质，可通过其抗氧化作用促进肠道菌群的生长，保持组织的活力。因此，我们认为氨基丁基可能会促进Roseburia spp.定植，表明XCQ配方对大鼠肠蠕动有促进作用。

6. RNA测序

我们用RNA-seq技术检测对照组、STC组和XCQ组大鼠结肠组织的RNA谱。我们总共鉴定了24956个基因，这些基因至少在一个样本中表达。对照组表达基因的数目为23085，STC组为23238，XCQ组为23510。为了确定差异表达基因(DEGs)，我们将模型组与对照组、XCQ组和STC组之间的p值<0.05作为三组基因表达的筛选标准。总体而言，在STC组和对照组中，我们发现了1238个上调的DEGs和1246个下调的DEGs，在XCQ组和STC组中发现了1549个上调的DEG和1212个下调的DEGs(图5A)。以log|Fc|>1和PADJ<0.05为标准，我们共鉴定出2760个基因，其中上调的基因有145个，下调的基因有102个。通过组织RNA-seq对比，我们获得IL-21R、PIK3CD、CD40等基因表达的差异。GO富集分析表明，DEGs主要与细胞(包括IL-6/IL-6R、IL-21/IL-21R)之间的信号转导、受体和配体连接以及多种信号相关通路有关，如NF-kappa B信号通路和转化生长因子-β信号通路。我们在蛋白质水平上验证了CD117、IL-21R及其下游分子的变化(图5B-E)。因此，我们认为XCQ对CD117表达和肠蠕动的调节作用可能与炎症环境有关，如IL-21R。

图5小承气配方在结肠转录组水平对STC大鼠的影响

A，STC组与对照组(左)和实验组与对照组(右)之间的基因表达情况，下调基因(绿色)、上调基因(红色)和无显著差异基因(蓝色)；B，IL-21R、CD40和pik3cd在三组之间的表达差异有统计学意义，*p<0.05；C-E，CD117、IL-21R的蛋白表达水平及其下游的STAT3在各组之间的激活水平；F，CD117、IL-21及其下游的STAT3在大鼠结肠的表达情况。

7. 洛哌丁胺诱导大鼠结肠ICC凋亡的实验研究

为了阐明其调控机制，我们从大鼠原代结肠ICC中提取了IL-21R，并用免疫荧光法检测了ICC中IL-21R的表达(图6A)。我们用不同浓度的洛哌丁胺处理细胞，以时间剂量依赖性的方式诱导ICC凋亡，其中48小时的半抑制浓度(IC50)约为12 µM (图6B，C)。

图6洛哌丁胺对大鼠Cajal间质细胞的影响

A，免疫荧光检测IL-21R(红色)和c-kit(绿色)的表达情况；B，不同浓度的洛哌丁胺处理细胞后，可诱导细胞发生凋亡，且呈时间浓度依赖性特征，48h的IC50值约为12 μM；C，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；D，流式细胞仪检测BAB对洛哌丁胺诱导细胞凋亡的影响；E，不同浓度的BAB处理模拟细胞；(F)用Western blotting检测caspase通路相关蛋白。*p<0.005，*p<0.001。

8. BAB对大鼠ICC细胞的抗凋亡作用

为了阐明先前实验中筛选出的代谢物BAB对ICC的影响，我们用不同浓度的洛哌丁胺模拟ICC模型，表明洛哌丁胺可以诱导大鼠ICC的时间剂量依赖性的凋亡。为观察对细胞存活的影响，我们在造模后24 h加入2 μM的BAB。膜联蛋白V-FITC/PI染色和WB结果显示，BAB可以保护ICC活性，并抑制ICC诱导的caspase依赖性的凋亡反应(图6D-F)。此外，BAB的抗凋亡作用随着STTAIC的使用而消失，这表明BAB可以通过调节STAT3通路来实现对ICCs的保护作用(图6D，F)。

9. BAB抑制洛哌丁胺诱导的人结肠ICC细胞凋亡

我们用磁珠提取并纯化人结肠ICCs，用流式细胞仪检测c-kit和IL-21R在细胞中的表达情况(图7A)。我们用免疫荧光法检测细胞内IL-21R的表达(图7B)。CCK-8结果显示，0-10 μM BAB作用72 h后，ICCs数量增加(图7C)。定量聚合酶链式反应(PCR)、流式细胞仪和caspase途径的蛋白水平在洛哌丁胺处理后的细胞中以浓度和时间依赖的方式被检测到。BAB的加入在一定程度上抑制了ICC的进一步凋亡(图7D-G)。

图7 BAB对人结肠Cajal间质细胞的影响

A，流式细胞术显示了纯化前(红色)和纯化后(蓝色)细胞中c-kit的表达；B，CCK-8显示，洛哌丁胺也可以诱导ICC中的浓度依赖性凋亡；C，通过免疫荧光鉴定了ICC中IL-21R(红色)和c-kit(绿色)的表达；D，qPCR检测相关基因的表达变化；E，细胞免疫荧光染色显示用不同浓度的BAB处理后人结肠ICC中c-kit的表达；F，用BAB处理后的细胞周期变化，统计分析列在右边；G，通过蛋白质印迹(WB)检测细胞周期相关蛋白的表达和Akt和ERK途径的激活。**p < 0.01，***p < 0.001。

10. BAB通过干扰细胞表面的IL-21R活性和调节下游信号通路来保护ICC在人结肠中的存活

根据文献综述，JAK/STAT3和MEK/ERK途径都可以被IL-21R调节。在这项研究中，IL-21R在ICC中的表达已被证实。用洛哌丁胺(LOP)处理后，细胞活力以浓度依赖性方式显著降低(图8A)。WB图像显示caspase途径被激活，p-STAT3和p-ERK均上调(图8B)。我们发现似乎STAT3和ERK通路都受到调节。此外，我们发现BAB降低了LOP在人ICCs中的凋亡诱导效应(图8C)。因此，我们希望进一步阐明BAB保护ICC的潜在机制，以及BAB保护ICC的机制是否与IL-21R、STAT3和ERK通路有关。我们敲除了IL-21R，并通过定量实时PCR和WB分析验证了这一点(图9A，B)。结果显示，细胞增殖甚至更慢，并且细胞被阻滞在G1/S期(图9C)。WB图像显示，在IL-21R沉默后，p-STAT3和p-ERK也在蛋白质水平受到抑制，BAB失去了对ICC的保护作用，在BAB处理后，PARP、caspase-3和caspase-9的图像几乎与LOP组中的图像相同，并且凋亡率没有降低(图9D，E)。因此，我们认为氨基苯通过激活IL-21R影响细胞存活。

图8 BAB可逆转洛哌丁胺诱导的Cajal间质细胞凋亡

A，CCK-8法显示洛哌丁胺也能诱导ICC在24 h出现浓度依赖性凋亡；B，通过WB检测凋亡相关caspase通路蛋白的表达以及STAT3和ERK的激活；C，通过流式细胞仪检测细胞凋亡。**p < 0.005，***p < 0.001。

图9敲除IL-21R可以抑制Cajal间质细胞的细胞活性

A，QPCR显示IL-21R在转录水平被敲除；B，在IL-21R siRNA转染后，细胞表面上IL-21R的表达降低；C，通过流式细胞术检测细胞周期的变化。*p < 0.01，***p < 0.001。D，caspase途径的WB图像和STAT和ERK的磷酸化水平。E，用流式细胞仪检测细胞凋亡。**p < 0.005，***p < 0.001。

11. BAB可以通过激活ERK/STAT3信号通路逆转LOP诱导的ICC凋亡

在蛋白质水平，我们用STAT3抑制剂处理细胞以抑制STAT3磷酸化，BAB的抗凋亡作用被消除(图10A)。虽然p-STAT3被显著抑制，但caspase途径仍然被激活，并且p-ERK的表达没有因BAB治疗而显著降低(图10B)。此外，当ERK的磷酸化被抑制，细胞凋亡现象没有减少，而p-STAT3表达明显减少(图10C，D)。这表明ERK在IL-21R调节的细胞存活中位于STAT3的上游，BAB通过干预ICCs表面的IL-21R激活ERK/STAT3信号通路，并逆转洛哌丁胺诱导的ICCs凋亡。

图10 BAB能逆转lop诱导的Cajal间质细胞凋亡

A，用流式细胞仪检测STAT3被抑制和激活后的细胞凋亡；B，WB用于检测STAT3被抑制和激活后的细胞凋亡；C，流式细胞仪检测STAT3或ERK被抑制和激活后的细胞凋亡；统计分析如下所示；D，PD98059和STATTIC用于抑制STAT3和ERK的激活。WB法检测caspase通路相关蛋白的表达、细胞增殖以及STAT3和ERK的激活。

慢性便秘是临床上常见的肛肠疾病。目前，美国人便秘的患病率约为16%，其中46%–74%为STC。STC的特征是结肠通过时间延长、运动减少和盆底功能正常，并在老年人中更常见。STC的病因复杂，其发病机制尚未完全明确。

中医的学术理论与西医有很大不同。中药中的生物活性成分主要是高分子化合物。它们的生物利用度和药物性质不能被人体吸收和利用，因为它们会被消化。因此，从西方药理学的角度来看，人们很难调和中医的临床疗效。因此，我们从中医的整体观和西医理论的具体病理变化两个方面探讨了XCQ方治疗慢性便秘的机理。从西医的角度来看，肠道菌群和免疫系统可能会解释中医的整体观点，并将两种理论联系起来。

最近，肠道微环境在胃肠动力障碍(如STC)的发病机制研究中备受关注，其中肠道菌群结构和相关代谢物的变化起着至关重要的作用。许多研究表明，肠道菌群对膳食纤维的消化能力以及纤维与微生物的相互作用可改变粪便的形状、重量和结肠运输能力，而短链脂肪酸过多和胆汁酸缺乏可导致蠕动和结肠分泌减少。此外，在肠道菌群和肠道内容物相互作用的过程中，一些慢性便秘患者体内众所周知的益生菌(如双歧杆菌和乳酸菌)的数量显著减少。在慢性便秘患者中，肠道菌群的组成变化是便秘的独立危险因素。类杆菌占便秘患者结肠菌群的大多数，结肠转运功能与肠道菌群的多样性、粪便中的短链脂肪酸和血浆乙酸含量显著相关。

越来越多的证据表明，中医药可以通过改善肠道微生物群的组成，产生有用的代谢物，增加肠道黏膜的分泌，减少水的重吸收，促进肠道蠕动来改善排便。国内中医医院使用的中药复方在治疗慢性便秘方面往往取得了很好的疗效，但由于其作用机制尚不明确，一直没有得到推广。

据认为，组织病理学变化，如肠神经系统病变、ICC、平滑肌和肠神经递质的变化，是诱发STC的重要因素。研究发现，随着年龄增长，肠肌间神经节减少，神经退行性改变增多，可能引起结肠动力学功能障碍。而且，各种胃肠神经递质，如血管活性肽的异常分泌、血清素受体的异常表达，都可能与STC的发生有关。平滑肌是胃肠活动的最终效应器。STC患者结肠平滑肌可出现不同程度的病变，包括不同程度的平滑肌纤维萎缩和纤维化，这会导致平滑肌收缩功能下降。Cajal基质细胞被称为胃肠道的起搏细胞，可以调节肠平滑肌的收缩。Cajal细胞的数量和表型异常与STC的发生发展密切相关。c-kit (CD117)受体在ICC的细胞质和细胞膜中广泛表达，并通过与其天然配体SCF结合来调节MAPK、PI3K/Akt、Wnt和其他信号通路，SCF决定ICC的分化和功能。结肠组织中ICC的量通常反映在c-kit蛋白的表达水平中。

XCQ配方是在《伤寒论》代表性药剂XCQ汤的基础上改良而成的。在本研究中，我们在XCQ汤的基础上增加了黄芪、当归、地黄和丹参，使其更适合STC患者。在之前的研究中，人们将XCQ配方用于结肠吻合术患者，结果显示，使用XCQ配方的结肠癌患者肠功能恢复时间明显短于接受常规术后治疗的患者。基于临床应用经验，我们发现XCQ配方可显著改善STC患者的排便。迄今为止，该配方的详细作用机制和微生物群落的参与尚未阐明。为了解决这些问题，我们在研究开始时使用洛哌丁胺进行注射并建立了STC大鼠模型，并用XCQ配方进行治疗(图2)。结果表明，与模型组相比，XCQ配方治疗的STC大鼠排便量和粪便含水量显著增加。碳末推进测试表明，实验组的肠道运输功能明显改善。XCQ配方增加了STC模型组大鼠肠组织中ICC的数量。这些结果表明，XCQ配方显著改善STC大鼠的排便，这与STC临床患者的治疗结果一致。

为了进一步探索XCQ配方的作用机制，我们利用16S rDNA测序技术对从大鼠粪便中提取的DNA进行了测序。与正常对照组相比，STC组粪便中含有丰富的各种细菌，包括厚壁菌门、梭状芽孢杆菌属、毛螺菌科和Roseburia spp.菌属。同时，粪便代谢组学检测显示，STC组的BAB含量显著增加，并与Roseburia spp.菌属丰度的变化呈正相关。因此，我们推测XCQ配方可以促进Roseburia spp.菌属的定植。在STC大鼠中，叶酸、苯甲酸和嘌呤的代谢以及代谢后BAB的生成增加。BAB是一些菌群的必需营养物质，通过抗氧化作用促进其生长并维持组织活性。因此，我们认为BAB可能促进了Roseburia spp.的定植,并促进肠蠕动。

此外，大鼠结肠组织的RNA-seq比较显示IL-21R、PIK3CD、CD40和其他基因的表达存在显著差异，GO和KEGG功能预测显示代谢物对细胞之间的信号转导、受体和配体连接有显著影响。此外，我们在蛋白质水平上验证了c-kit、IL-21R及其下游分子的变化。因此，我们认为XCQ配方对c-kit表达和肠蠕动的调节作用可能与炎症环境有关，如IL-21R。IL-21R主要在免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞)和非免疫细胞(树突细胞、成纤维细胞和肠上皮细胞)中表达。IL-21可促进肿瘤和炎症性疾病如肠道慢性疾病、I型糖尿病和类风湿性关节炎中的细胞增殖和分化，其α/γ链可与IL-21结合形成复合物，激活JAK1和JAK3及其下游STAT3、STAT1、STAT5A和STAT5B以及PI3K/Akt信号通路来调节细胞生长。研究表明，IL-21R的激活可以抑制Th1并激活Th2、Th17和Treg反应，从而有助于缓解DSS诱导的急性结肠炎，IL-21R可能是治疗炎症性肠病和其他肠动力障碍的新靶点。然而，在便秘的治疗中，很少有关于ICC和炎症环境之间关系的研究。因此，本研究可以为STC的有效治疗确定一个新的靶点。

基于以前的研究，我们发现BAB是XCQ配方的差异代谢物，可以有效改善便秘患者的肠运动。BAB是由4-氨基苯甲酸(PABA)的羧基和丁烷-1-醇的羟基通过缩甲醛形成的氨基酸酯。PABA是某些植物群的必要营养物质，通过抗氧化作用，促进肠道菌群生长，维持组织活性。质谱分析表明，PABA是XCQ配方的有效成分。丁烷-1-醇可由人和小鼠肠道微生物少量产生，如polyphycococcus、乳酸菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌。动物实验表明，XCQ可以促进肠道梭菌，特别是产丁酸细菌的定植，或增加肠道代谢物丁烷-1-醇的含量。然而，在粪便的代谢组学检测中，我们在三组粪便代谢物中均未鉴定出PABA，但PABA的产物BAB的含量有显著差异。我们推测，XCQ中的PABA在肠道和肠道菌群中合成一定量的BAB后，可以作用于肠道组织，促进肠道ICC的增殖。

为了阐明BAB(XCQ配方的代谢物)的作用机制，我们从大鼠中提取了原代结肠ICC，通过细胞免疫荧光检测了ICC中IL-21R的表达，用洛哌丁胺构建了STC模型，并用BAB处理了细胞。最后，我们在人类原发性结肠ICC中验证了潜在的机制，以验证我们在不同物种中的结论。结果表明，洛哌丁胺可以诱导大鼠和人结肠ICC的caspase依赖性凋亡，而足够浓度的氨基丁基可以抑制ICC的进一步凋亡，起到保护作用。WB分析和流式细胞仪显示BAB通过促进STAT3和ERK磷酸化减轻了洛哌丁胺诱导的ICC凋亡。此外，当IL-21R从ICC表面敲除时，BAB对ICC的抗凋亡作用被消除。事实上，洛哌丁胺诱导的ICC凋亡不能被IL-21R沉默抑制，并且IL-21R的STAT3和ERK下游分子不能被激活。当使用STATTIC时，STAT3的抑制剂和ERK途径的抑制剂PD98059可用于处理细胞并抑制STAT3和ERK的激活，BAB对ICC的保护作用也被消除，并且p-STAT3表达的减少，而PD98059可抑制ERK的磷酸化。然而，STATTIC治疗不能抑制p-ERK的表达。在氨基丁基对ICC的保护机制中，ERK位于STAT3的上游。因此，我们认为BAB可以通过干扰ICC表面的IL-21R活性，激活下游的ERK/STAT3信号通路，促进ICC增殖，逆转洛哌丁胺诱导的ICC细胞凋亡。因此，XCQ配方促进了Roseburia spp.菌属的定植，并增加代谢后BAB的含量，保护ICC活性，从而改善STC症状。

本研究在中医理论的指导下，建立慢传输型便秘大鼠模型，研究了中药XCQ方治疗STC的作用机制。我们发现肠道菌群和代谢变化在STC的发病和治疗中起着重要作用。我们的研究结果为临床合理有效地使用中药提供了坚实的理论基础。

然而，这项研究有一些局限性。如上所述，中药的成分是复杂的。因此，XCQ配方及其代谢物与Roseburia spp.之间的因果关系、其他代谢物对肠动力的影响以及IL-21释放在STC患者肠道炎症环境改变中的作用，都需要进一步的实验研究。此外，BAB的详细来源及其与Roseburia spp .属的关系尚未被澄清，并需要进一步核实。例如，我们应建立STC不育大鼠模型，并用XCQ配方进行治疗。我们应观察大鼠结肠运输功能、组织学变化和CD117表达，以确定STC的治疗效果，并检测肠道菌群和主要代谢物，以进一步研究XCQ配方与Roseburia spp .之间的关系。此外，我们有必要进一步开发XCQ配方的优势菌群和代谢物在临床使用中对STC的有益作用，确定用XCQ配方治疗的STC患者的肠道菌群和免疫状态的差异，以及确定该配方对STC患者的内环境的影响。

结论

本研究旨在探讨大鼠STC模型ICC的病理变化及中药方剂XCQ的治疗机制。XCQ配方恢复了STC大鼠的结肠动力指数、结肠损伤和ICC数量。结合前人的研究结果，我们推测XCQ配方能够促进Roseburia spp .的定植，增加代谢物BAB的生成，保护ICC的活性，从而改善STC的症状。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.864598/full

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