溃疡性结肠炎（ ulcerative colitis ， UC ）是一种慢性免疫介导的结肠炎症性疾病 [1] 。流行病学调查显示，在世界范围内， UC 的发病率正逐年增加 [2] ，目前国内 UC 的发病率达 1.16/ 万 [3] 。由于病程长、病变反复、并发症较多，甚至增加结直肠癌发生的风险 [4] ， UC 已经成为威胁我国居民健康的重要疾病之一。近年来，在 UC 发病机制研究中发现，肠道菌群与免疫系统之间相互作用是影响肠道乃至整个机体健康状态的一个关键因素 [5] 。真菌是肠道菌群的重要组成部分，其中白念珠菌是最常见的人类共生真菌，也是人类最常见的真菌机会性病原体 [6] 。动物实验显示， UC 大鼠肠道白念珠菌含量明显上升 [7] ，且伴随给药时间延长，其含量逐渐下降并呈现明显量效关系 [8] 。本课题组前期研究发现，白念珠菌异常定植肠道可加重小鼠 UC 的病情，抗白念珠菌治疗可显著提高 UC 的治疗效果 [9] 。在临床上，糖皮质激素及免疫抑制剂的使用，使继发白念珠菌机会感染突增 [10] ，造成患者的病情呈现经常反复的特点。肠道白念珠菌过度定植时，巨噬细胞内 Dectin-1/ 脾酪氨酸激酶（ spleen tyrosine kinase ， Syk ）通路得以激活，进而对 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3 （ NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 ， NLRP3 ）炎症小体过度激活而释放大量白细胞介素 -1β （ interleukin-1β ， IL-1β ）、 IL-18 ，破坏肠道黏膜屏障，引起结肠组织的炎症损伤，参与了 UC 的致病作用 [11-12] 。因此，白念珠菌在肠道过度定植与 UC 病情程度之间呈现出很强的相关性，白念珠菌可以被视为从微生态角度进行干预从而治疗 UC 的一个重要靶标 [9] 。

白头翁汤（白头翁 15 g 、黄柏12 g 、黄连6 g 、秦皮15 g ）出自《伤寒论》，为中华中医药学会脾胃病分会推荐治疗UC 的方药[3] 。临床研究表明，白头翁汤对UC 具有良好的疗效。体外实验也证明白头翁汤正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction ，BAEB ）对白念珠菌具有明显抑制作用[13-14] 。本课题组前期也进行了大量的实验，发现BAEB 对于白念珠菌定植下的UC 小鼠有着显著的治疗效果。然而，白头翁汤对白念珠菌定植下的UC 的作用机制尚不清楚。故本研究拟从肠道白念珠菌的过度定植角度出发，通过检测Dectin-1/Syk 通路、NLRP3 炎症小体相关指标的变化以及反映肠黏膜屏障功能的Occludin 和闭锁连接蛋白-1 （zonula occludens-1 ，ZO-1 ）蛋白表达情况，探讨BAEB 对UC 的作用机制，以期为可能将BAEB 开发为作用机制新颖、临床疗效显著的抗UC 药物奠定坚实的理论基础和实验依据。

1材料

1.1动物

SPF 级雄性KM 小鼠105 只，6 ～8 周龄，体质量18 ～22 g ，购自安徽医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK （皖）2017-001 ，安徽省实验动物质量合格证号No.340729210100005024 。小鼠于动物房适应性饲养1 周，明暗交替12 h /12 h ，室温维持20 ～26 ℃，相对湿度维持40% ～70% ，自由进食饮水。动物实验经安徽中医药大学动物伦理委员会批准（批准号AHUCM-2021007 ）。

1.2菌株

白念珠菌标准株SC5314 由中国人民解放军第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。

1.3药材

白头翁、黄柏、黄连、秦皮购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经安徽中医药大学高家荣主任药师鉴定分别为毛茛科植物白头翁 Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel 的干燥根、芸香科植物黄皮树 Phellodendron chinense Schneid 的干燥树皮、毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch 的干燥根茎和木犀科植物苦枥白蜡树 Fraxinus rhynchophylla Hance 的干燥枝皮。

1.4药品与试剂

美沙拉嗪肠溶片（批号 10402226 ，0.25g/ 片）购自葵花药业；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt ，DSS ，批号S3045 ）购自美国MP Biomedicals 公司；小鼠IL-1β 、IL-18 ELISA 试剂盒（批号分别为01/2021 、01/2021 ）购自上海酶联生物科技有限公司；β- 葡聚糖ELISA 试剂盒（批号202101 ）购自上海科兴生物科技有限公司；核因子-κB （nuclear factor-κB ，NF-κB ）p65 抗体、凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD ，ASC ）抗体、山羊抗兔IgG 抗体（批号分别为ATTNO2501 、ATSAP1701 、ATSAP0901 ）购自美国Abbkine 公司；ZO-1 抗体、Occludin 抗体、F4/80 抗体、ECL 超敏发光试剂盒、山羊抗小鼠IgG 抗体、β-actin 抗体（批号分别为44h7470 、53t8241 、44k4122 、1824c03 、19z2345 、54o2802 ）购自美国Affinity 公司；NLRP3 抗体、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 （cleaved cystein-asparate protease-1 ，cleaved Caspase-1 ）抗体（批号分别为15101S 、4 ）购自美国CST 公司；Syk 抗体（批号104032427 ）购自沈阳万类生物科技有限公司；Dectin-1 抗体（批号E0317 ）购自美国Santa Cruz 生物技术公司；RIPA 细胞裂解液（强）、预染蛋白Marker 、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为AUKJH 、AUKPW 、SPHNU ）购自山东思科捷生物技术有限公司；法国科玛嘉念珠菌显色培养基（批号P002076 ）购自上海欣中生物工程有限公司；聚山梨酯20 （批号20CS1808 ）购自北京金克隆生物技术有限公司；牛血清白蛋白（批号EZ5679A168 ）购自德国Biofroxx 公司 。

1.5仪器

H1-16kr 型高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；K3 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific ）；RM2016 型组织切片机（德国Leica 公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 5200 型全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

2方法

2.1BAEB的制备

按照文献方法[9] 制备BAEB ，在提取过程中，通过检测白头翁皂苷B4 、秦皮甲素、小檗碱含量，并注意有机溶剂浓度、有机溶剂用量、提取时间、提取次数4 个因素进行质量控制[15] 。BAEB 中主要成分含量见表1 。

2.2白念珠菌悬液的配制

将白念珠菌接种于装有液态沙氏培养基的锥形瓶中，置于37 ℃恒温摇床中培养12 h 。取出，离心收集后将菌液浓度调整至1 ×109 CFU/mL 备用。

2.3白念珠菌异常定植下的小鼠UC模型建立与药物干预

参考马克龙等 [16] 与Choteau 等[17] 方法，采用DSS 自由饮用结合ig 白念珠菌的方法构建白念珠菌定植小鼠UC 模型。小鼠随机分为对照组、DSS 组、DSS ＋白念珠菌组及BAEB 低、中、高剂量（20 、40 、80 mg/kg ）[18] 组和美沙拉嗪（200 mg/kg ）组，每组15 只。对照组小鼠自由饮用蒸馏水；DSS 组小鼠自由饮用3% DSS 溶液，连续7 d ；DSS ＋白念珠菌组及各给药组小鼠自由饮用3% DSS 溶液，同时隔日ig 0.1 mL 白念珠菌，连续4 次。第8 天，各给药组ig 相应药物，对照组和DSS 组ig 等体积生理盐水，1 次/d ，连续7 d 。

2.4小鼠一般体征观察和疾病活动指数（disease activity index，DAI）计算

每日观察小鼠的精神、饮食、活动和毛发等一般状况，记录小鼠体质量、大便性状和便血情况，对小鼠DAI 进行评分，评分标准见表2 。

2.5结肠长度、黏膜损伤指数、组织病理形态学观察及评分

小鼠麻醉后眼球取血，离心获取血清， − 20 ℃冰箱保存备用。颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作下迅速剖开腹腔，切取小鼠结肠，测量结肠长度，观察结肠水肿、溃疡等损伤程度，并进行结肠黏膜损伤指数（colon mucosa damage index ，CMDI ）评分，评分标准：组织无损伤，0 分；局部充血、无溃疡，1 分；局部充血、肠壁增厚、无溃疡，2 分；有溃疡、直径＜1 cm ，3 分；溃疡直径1 ～2 cm 、与外周无粘连，4 分；溃疡直径约1 ～2 cm 、肠管增厚、与外周脏器黏连，5 分。切取一部分结肠，于4% 多聚甲醛中固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，苏木素- 伊红（HE ）染色，于光学显微镜下观察结肠病理学变化，按照文献方法[19] 进行评分，评分标准见表3 。剩余结肠组织于−80 ℃冰箱保存，用于后续实验。

2.6肠道白念珠菌载荷量评估

收集各组小鼠第1 、5 、9 、13 天的粪便，干燥、称定质量后，重悬于预冷的PBS 中，涂布在含有双抗的科玛嘉显色固体培养基上，于37 ℃恒温培养24 h ，计数平板上白念珠菌微菌落的数量。

2.7免疫组化检测结肠组织Occludin和ZO-1蛋白表达

肠组织石蜡切片脱蜡至水， 3% 过氧化氢封闭10 min ，柠檬酸盐缓冲液微波辐射抗原修复，羊血清封闭。分别加入Occludin （1 ︰100 ）、ZO-1 （1 ︰100 ）抗体，4 ℃孵育过夜；加入二抗，37 ℃孵育30 min ，加入SABC 和DAB 显色剂后，经苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。于显微镜下观察，棕黄色或棕褐色颗粒的细胞为阳性细胞。

2.8ELISA检测结肠组织IL-1β、IL-18水平

取各组小鼠结肠组织，称定质量，加适量 PBS ，匀浆，离心，收集上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测IL-1β 、IL-18 水平。

2.9Western blotting法检测结肠组织NLRP3、Dectin-1、Syk、NF-κB、ASC和cleaved Caspase-1蛋白表达

取结肠组织，加液氮后用研钵研碎，根据组织蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白样品。 BCA 法对蛋白进行定量，蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电 泳 ，转至PVDF 膜， 封闭后，以TBST 漂洗，分别加入Dectin-1 （1 ∶1000 ）、NF-κB （1 ∶2000 ）、Syk （1 ∶10 000 ）、ASC （1 ∶2000 ）、cleaved Caspase-1 （1 ∶1000 ）、NLRP3 （1 ∶1000 ）和β-actin （1 ∶1000 ）抗体，4 ℃孵育过夜；TBST 漂洗后，加入HRP 标记的二抗（1 ∶1000 ），室温孵育2 h ，漂洗后加入ECL 化学发光液显色，采用凝胶成像系统观察结果，并进行灰度分析。

2.10统计学分析

所有实验数据用 SPSS 20 统计分析软件进行处理，数据用 表示。采用单因素方差（One-way ANOVA ）分析和LSD 检验（方差不齐时用Dunnett’s T3 检验）对组间变量进行多重比较。

3结果

3.1BAEB对小鼠一般状态和DAI的影响

对照组小鼠毛发色泽、饮食、精神、大便均正常； DSS 组小鼠在自由饮用DSS 溶液3 d 后，出现行动迟缓、食欲减退和稀便，且随着时间延长，症状逐渐加重，出现黏液便和血便，DAI 逐渐增大（表4 ）；DSS ＋白念珠菌组小鼠的症状和体征与DSS 组相似，但出现稀便和血便的时间更早，DAI 升高更明显，与同时间点对照组相比有显著差异（P ＜0.01 ）；第8 天，经BAEB 和美沙拉嗪治疗，上述症状均得到不同程度的改善，随着治疗时间的延长，DAI 开始下降，与同时间点DSS ＋白念珠菌组相比有显著差异（P ＜0.05 ）。在治疗组中，BAEB 中、高剂量组DAI 下降较明显，效果优于BAEB 低剂量组。BAEB 中、高剂量组之间无差别。说明BAEB 可以降低白念珠菌定植的DSS 诱导UC 小鼠DAI 评分，并且随剂量增加而降低，但当剂量达到一定程度后，效果不再增加。

3.2BAEB对小鼠结肠长度、CMDI、组织病理学和评分的影响

如表 5 所示，与对照组相比， DSS ＋白念珠菌组小鼠结肠长度明显缩短（ P ＜ 0.01 ）； BAEB 组和美沙拉嗪组结肠长度明显长于 DSS ＋白念珠菌组（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）； DSS ＋白念珠菌组结肠黏膜水肿、溃疡和糜烂，黏膜下见大量炎性浸润，上皮细胞破损，杯状细胞核腺体减少或排列不整齐（图 1 ）， CMDI 和组织病理学评分升高，与对照组相比有明显差异（ P ＜ 0.01 ）； BAEB 治疗后，小鼠结肠黏膜水肿、糜烂和溃疡明显减轻，上皮细胞破损明显减少，杯状细胞核腺体排列不整齐明显改善， CMDI 和组织病理学评分降低，与 DSS ＋白念珠菌组相比有显著差异（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。 BAEB 可以明显改善白 念珠菌定植的 DSS 诱导 UC 小鼠的结肠长度及 CMDI 评分，且呈剂量相关性，其中 BAEB 中、高剂量组效果优于美沙拉嗪组。组织病理学评分以 BAEB 中剂量组降低最明显，说明 BAEB 可以改善白念珠菌定植的 DSS 诱导 UC ，并随剂量增加而增加，但当剂量达到一定程度后，效果不再增加。

3.3 BAEB对小鼠肠道白念珠菌载荷的影响

收集小鼠第1 、5 、9 、13 天的粪便，在科玛嘉的培养板上培养，长出的蓝色光滑菌落是白念珠菌。如表6 所示，DSS ＋白念珠菌组小鼠粪便白念珠菌增多，与对照组相比有显著差异（P ＜0.01 ）；第8 天给予BAEB 后，白念珠菌在肠道定植能力下降，菌落形成单位（colony forming units ，CFU ）随着治疗时间延长逐渐减小，各治疗组与同时间点DSS ＋白念珠菌组相比有明显下降（P ＜0.01 ）；第13 天BAEB 中、高剂量组与DSS ＋白念珠菌组相比CFU 明显下降（P ＜0.01 ）。因此，BAEB 降低DSS 诱导UC 小鼠结肠CFU ，呈剂量相关性。


3.4BAEB对结肠组织Occludin和ZO-1蛋白表达的影响

如图 2 、3 所示，Occludin 和ZO-1 的表达定位于肠黏膜上皮细胞的细胞膜，镜下呈棕色。DSS ＋白念珠菌组Occludin 和ZO-1 阳性表达均降低。给予BAEB 治疗后，Occludin 和ZO-1 阳性表达上升，以BAEB 低、中剂量组效果明显（P ＜0.05 、0.01 ）。说明BAEB 低剂量下可明显促进Occludin 和ZO-1 的表达，且效果与美沙拉嗪相似。

3.5BAEB对小鼠结肠组织中IL-1β和IL-18水平的影响

如表 7 所示，与对照组相比，DSS 组与DSS ＋白念珠菌组小数结肠组织中促炎因子IL-1β 、IL-18 水平明显升高（P ＜0.01 ）；与DSS ＋白念珠菌组相 比， BAEB 各剂量组小鼠结肠组织中 IL-1β 、 IL-18 水平均明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。

3.6BAEB对小鼠结肠组织Dectin-1、NF-κB、Syk、ASC、cleaved Caspase-1和NLRP3蛋白表达的影响

如图 4 所示，与对照组相比，DSS ＋白念珠菌组小鼠结肠组织NLRP3 、NF-κB 和Dectin-1 蛋白表达水平均显著升高（P ＜0.01 ），ASC 、cleaved Caspase-1 和Syk 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.05 、0.01 ），且DSS ＋白念珠菌组的变化较DSS 组明显；与DSS ＋白念珠菌组相比，BAEB 低剂量组Syk 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.01 ）；BAEB 中剂量组ASC 和Syk 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05 、0.01 ），NLRP3 和NF-κB 蛋白表达水平均显著降低（P ＜0.05 、0.01 ）；BAEB 高剂量组ASC 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.01 ），NF-κB 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.01 ）。

4讨论

目前公认 UC 的发病机制与肠道菌群失衡及肠道免疫功能紊乱密切相关。近年来研究发现， UC 患者肠道内菌群多样性明显降低，白念珠菌比例显著增加 [20] ，白念珠菌在肠道过度定植与 UC 病情程度 呈强相关性。但是目前对肠道真菌菌群的研究相对较 少[21] 。

本研究中，通过饮用DSS 结合ig 白念珠菌构建白念珠菌异常定植下的小鼠UC 模型。结果显示，DSS ＋白念珠菌组小鼠粪便培养出的白念珠菌远多于对照组和DSS 组，且小鼠结肠黏膜损伤程度、血清和组织炎症因子水平均明显高于对照组和DSS 组，与文献报道一致[9] 。给予BAEB 治疗7 d 后，小鼠的便溏便血、体质量下降和结肠长度缩短等体征得到显著改善，DAI 评分明显下降，结肠黏膜的炎性细胞浸润、上皮细胞损伤、腺体紊乱和消失的现象有所减轻，肠道白念珠菌CFU 数明显减少，反映肠黏膜屏障功能的Occludin 和ZO-1 蛋白表达增加。结果提示，BAEB 对白念珠菌定植的UC 小鼠具有抑制肠道白念珠菌增殖、保护肠道黏膜屏障、减轻肠道炎症损伤的作用。

肠道白念珠菌过度定植时，白念珠菌通过转位激活肠黏膜组织内巨噬细胞 NLRP3 的表达、Caspase-1 的活化和IL-1β 、IL-18 的分泌[22] ，以NLRP3 炎性小体依赖性方式诱导初级巨噬细胞成熟并分泌IL-1β 、IL-18[23] 。炎症小体是一类由胞质内模式识别受体参与组装的多蛋白复合体，能够识别病原体表面的病原相关分子模式或者宿主来源的危险信号分子。当免疫细胞受到刺激时，炎症小体各组分结合成复合物，随后经过一系列酶解反应，产生和释放大量促炎性细胞因子IL-1β 和IL-18 。其中，对炎症小体的研究目前以NLRP3 为最多[24] 。

NLRP3 炎症小体复合物由识别分子NLRP3 、接头分子ASC 和效应分子Caspase-1 等组成。当免疫细胞被细菌、真菌、病毒等病原体的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns ，PAMPs ），以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate ，ATP ）、尿酸晶体、β 淀粉样纤维等损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular patterns ，DAMPs ）刺激时，NLRP3 炎症小体被激活。随后NLRP3 自身寡聚化，招募并活化ASC ，ASC 活化形成大分子的二聚体，招募并活化Caspase-1 前体。活化的Caspase-1 剪切pro-IL-1β 和pro-IL-18 ，产生IL-1β 和IL-18 并释放，引起宿主炎症反应[25] 。本研究中，DSS ＋白念珠菌组小鼠结肠组织促炎因子IL-1β 和IL-18 水平明显高于对照组，说明在DSS 诱导的基础上伴有白念珠菌的定植会加重UC 的炎症反应，可能与激活结肠黏膜组织内巨噬细胞，触发NLRP3 炎症小体活化，释放大量炎性因子IL-1β 和IL-18 ，造成结肠黏膜组织炎性损伤有关。白念珠菌异常定植可能参与这一过程。给予BAEB 治疗后，小鼠结肠组织中IL-1β 、IL-18 水平降低，结肠黏膜组织炎性损伤有所减轻，推测BAEB 可能是通过阻断NLRP3 炎症小体活化及相关信号通路，进而抑制IL-1β 、IL-18 释放并抑制白念珠菌定植，从而发挥作用。

真菌感染时，巨噬细胞内 Dectin-1/Syk 通路得以激活，并介导NLRP3 炎症小体活化，产生IL-1β 、IL-18 ，但大量IL-1β 、IL-18 的产生会引起相应组织的炎性损伤。为证实BAEB 可能通过靶向Dectin-1/Syk 通路及其介导的NLRP3 炎症小体从而抑制IL-1β 、IL-18 释放以缓解UC 的作用机制，检测Dectin-1/Syk 通路中相关蛋白与NLRP3 炎症小体的表达。白念珠菌细胞壁成分β-1,3- 葡聚糖作为PAMP 被宿主免疫细胞，特别是巨噬细胞上的模式识别受体Dectin-1 识别。Dectin-1 是膜相关C 型凝集素受体家族的最重要成员。当Dectin-1 结合β-1,3- 葡聚糖后，其胞内的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ，ITAM ）中的酪氨酸首先被Src 家族激酶磷酸化，继而招募Syk ，Syk 磷酸化后可激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2 （phospholipase Cγ2 ，PLCγ2 ）/Ca2+ ，促使蛋白激酶Cδ （protein kinase Cδ ，PKCδ ）活化，诱导Ca2+/ 活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells ，NFAT ）和活性氧（reactive oxygen species ，ROS ）/NLRP3 炎症小体的合成，即白念珠菌β-1,3- 葡聚糖可通过Dectin-1/Syk 信号通路活化NLRP3 炎症小体，进而产生大量IL-1β 与IL-18 。因此，该信号通路被视为白念珠菌感染引起NLRP3 炎症小体活化造成免疫炎症性损伤的一个重要干预靶标[12] 。本研究发现，给予BAEB 治疗后，Dectin-1 、NF-κB 、NLRP3 表达呈不同程度地降低，ASC 、Syk 和cleaved Caspase-1 表达上升。结果表明，BAEB 可能通过抑制Dectin-1 、NF-κB 、NLRP3 等蛋白的表达，抑制ASC 二聚体化及Syk 磷酸化等，抑制Dectin-1/Syk 通路介导的NLRP3 炎症小体过度活化，进而阻断IL-1β 与IL-18 的产生来发挥抗UC 作用。本研究发现，不同剂量的BAEB 治疗效果存在差异。综合各项指标，以BAEB 中剂量的作用效果较明显且稳定。说明BAEB 在治疗白念珠菌异常定植下的小鼠UC 时，治疗效果无剂量相关性，其作用效果有一个最佳药物剂量。

综上所述， BAEB 通过抑制白念珠菌定植，促进黏膜上皮修复，减轻结肠黏膜损伤与炎性细胞浸润，减少促炎因子IL-1β 和IL-18 的分泌，从而发挥对白念珠菌异常定植下的UC 的治疗作用，其作用机制可能与BAEB 抑制巨噬细胞Dectin-1/Syk 通路介导的NLRP3 炎症小体过度活化有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：王亚东，徐志庆，夏 丹，张梦翔，汪天明，邵 菁，汪长中． 基于NLRP3炎症小体研究白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌定植下小鼠溃疡性结肠炎的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(13): 3997-4006 .

— END—

【福利时刻】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。

SCI查重、润色，点击查看：

‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍ ‍