2026年5月，浙江中医药大学基础医学院、浙江省血瘀毒证重点实验室、浙江省中医药“治未病”智慧健康工程研究中心等团队，联合浙江省肿瘤医院病理科、浙江中医药大学金华研究院等单位，在Phytomedicine在线发表题为 “Targeting the lactate-lactylation-glucose uptake axis: Cryptotanshinone reprograms metabolic-epigenetic crosstalk in gastric cancer” 的研究论文。该文于2025年12月23日投稿，2026年5月10日修回，2026年5月26日接收，2026年5月28日在线发表。论文通讯作者为浙江中医药大学 Tao Jiang（姜涛） 和 Guangji Zhang（张光霁）。Phytomedicine 公开期刊信息显示其最新影响因子约为8.3，并被列为JCR Q1/中科院医学1区Top期刊。
胃癌仍是全球癌症相关死亡的重要原因之一。当前一线治疗主要依赖系统性化疗，但化疗耐药和严重不良反应限制了长期疗效。近年来，肿瘤代谢重编程受到广泛关注，其中乳酸不再只是糖酵解终产物，还可通过组蛋白乳酰化参与表观遗传调控，推动肿瘤生长、转移和免疫逃逸。该研究聚焦胃癌中的 乳酸-乳酰化-葡萄糖摄取轴，试图从代谢与表观遗传串扰角度寻找新的干预机制。
研究团队首先从丹参乙醇提取物（SME）入手，通过HPLC-MS分析共鉴定出596种化合物，并发现SME可降低胃癌细胞乳酸分泌和PEP水平，同时抑制烯醇化酶活性。进一步结合基于ENO1结构的高通量筛选、有限蛋白酶解-质谱（LiP-MS）、表面等离子体共振（SPR）、细胞热转移实验（CETSA）和DARTS实验，研究者鉴定出丹参活性成分 隐丹参酮（cryptotanshinone，CTS） 可直接结合并抑制 烯醇化酶1（ENO1）。
机制上，CTS通过靶向ENO1降低磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和乳酸生成，进而减少全局组蛋白乳酰化，尤其是 H3K18la。与此同时，CTS降低PEP水平后，可增强HDAC2介导的去乳酰化作用。H3K18la下降进一步抑制 MGAT4A 表达，削弱 GLUT1 的细胞膜定位和葡萄糖摄取，从而形成“葡萄糖摄取-糖酵解-乳酸生成”负反馈环路，系统性抑制胃癌细胞能量供应。
在功能验证方面，CTS在胃癌细胞中抑制增殖、迁移和三维侵袭，并在较高浓度下诱导凋亡。体内异种移植瘤实验显示，CTS可剂量依赖性减缓肿瘤生长，高剂量组抗肿瘤效果接近阳性对照顺铂；同时，小鼠主要器官HE染色及ALT、AST、BUN、CREA等指标未见明显毒理学变化。更进一步，研究团队构建患者来源胃癌类器官（PDOs），发现CTS同样能够抑制类器官生长和乳酸分泌，而外源性乳酸可部分逆转CTS的抑制作用，进一步支持“乳酸依赖性”机制。
总体来看，该研究从天然产物活性成分筛选出发，建立了“CTS-ENO1-PEP/乳酸-H3K18la-MGAT4A/GLUT1”的机制链条，揭示隐丹参酮可通过重塑胃癌代谢-表观遗传串扰抑制肿瘤进展。这一发现不仅拓展了丹参活性成分隐丹参酮的抗肿瘤机制，也为靶向乳酸代谢和组蛋白乳酰化的胃癌干预策略提供了前临床依据。需要强调的是，该研究主要基于细胞、异种移植瘤和患者来源类器官模型，尚不能直接等同于人体临床疗效，后续仍需进一步开展药代动力学、安全性和临床转化研究。
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【摘要】
背景：胃癌仍是全球癌症相关死亡的重要原因之一。化疗耐药和严重不良反应，是当前治疗面临的主要挑战。代谢重编程，尤其是乳酸驱动的组蛋白乳酰化，在肿瘤进展中发挥关键作用。隐丹参酮（cryptotanshinone，CTS）是来源于丹参（Salvia miltiorrhiza）的活性成分，已显示出抗肿瘤特性，但其在胃癌中调控乳酸代谢和乳酰化的机制尚不清楚。
目的：本研究旨在阐明 CTS 抑制胃癌进展的分子机制，重点关注其对烯醇化酶活性、乳酸生成、组蛋白乳酰化以及下游代谢-表观遗传调控的影响。
方法：研究者筛选丹参乙醇提取物（Salvia miltiorrhiza ethanol extract，SME），并鉴定出 CTS 是靶向烯醇化酶的关键成分。研究采用分子对接、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）和有限蛋白酶解-质谱（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）确认 CTS 与烯醇化酶 1（enolase 1，ENO1）之间的相互作用。随后，研究者利用细胞系、异种移植瘤和患者来源类器官（patient-derived organoids，PDOs）等体内外模型评估 CTS 的抗肿瘤效应，并通过 Seahorse 检测、Western blot、Cut&Tag 和 RNA-seq 等方法分析糖酵解功能、组蛋白乳酰化和基因表达变化。
结果：CTS 可直接结合并抑制 ENO1，从而降低磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和乳酸生成。乳酸水平下降进一步降低全局组蛋白乳酰化，尤其是组蛋白 H3 第 18 位赖氨酸乳酰化（histone H3 lysine 18 lactylation，H3K18la）。此外，CTS 通过降低 PEP 水平增强组蛋白去乙酰化酶 2（histone deacetylase 2，HDAC2）介导的去乳酰化作用，而 PEP 原本可抑制 HDAC2。H3K18la 下调抑制 MGAT4A 表达，削弱葡萄糖转运蛋白 1（GLUT1）的细胞膜定位和葡萄糖摄取，从而形成抑制糖酵解的反馈环路。CTS 在异种移植瘤和患者来源类器官模型中显著抑制肿瘤生长，而外源性乳酸可逆转这一效应。
01
研究背景及科学问题
胃癌仍是全球重要的健康挑战，也是癌症相关死亡的主要原因之一。目前，一线治疗主要依赖系统性化疗。然而，化疗疗效常受到耐药和严重不良反应限制，长期治疗结局并不理想。当前，程序性死亡配体 1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达、微卫星高度不稳定（high microsatellite instability，MSI-H）和肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）等生物标志物已被用于指导免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）治疗，但它们在预测化疗反应方面仍存在局限。此外，目前仍缺乏可靠的生物学指标来识别哪些患者更可能从化疗中获益，这直接导致个体间对系统性化疗的反应差异显著。在精准肿瘤学时代，亟需发现新的分子靶点，并开发能够选择性抑制肿瘤进展、同时降低毒性的治疗策略。
越来越多证据表明，代谢重编程在癌症发生发展中具有重要作用。在多种代谢物中，乳酸已被认为是胃癌中的关键致癌代谢物。乳酸不仅是糖酵解的终产物，还可通过一种新发现的翻译后修饰形式——乳酰化（lactylation）参与细胞信号传导和表观遗传调控。组蛋白乳酰化，尤其是 H3K9、H3K14 和 H3K18 等赖氨酸位点的乳酰化，可直接促进与肿瘤生长、转移和免疫逃逸相关的基因转录。乳酸驱动的这种表观遗传重编程可形成前馈环路，维持胃癌侵袭性表型。因此，靶向乳酸代谢或乳酰化，可能成为一种有前景的治疗方向。
中医药长期以来将草本化合物用于肿瘤治疗。丹参在传统应用中常用于活血化瘀，现代研究也证实其具有抗肿瘤特性。在丹参活性成分中，隐丹参酮（CTS）是含量较高且具有代表性的二萜醌类化合物之一，已在多种恶性肿瘤中显示出抗癌作用。既往研究提示，CTS 可抑制糖酵解和氧化磷酸化，并调控 STAT3/SIRT3 等信号通路。虽然已有研究显示 CTS 对乳酸调控具有重要影响，但其在胃癌中是否影响乳酰化介导的表观遗传调控，以及其在糖酵解通路中的直接分子靶点，仍缺乏深入研究。本研究鉴定了 CTS 调控乳酸的直接生物学靶点，并阐明了其降低组蛋白乳酰化的三重作用，为 CTS 后续作为分子工具开发和应用提供了新的依据。
02
重要发现及亮点
丹参乙醇提取物可抑制烯醇化酶活性
丹参的抗肿瘤价值已有较多研究基础，尤其与其丹参酮类和酚酸类成分相关。研究者首先采用两亲性溶剂对丹参进行纯化，制备丹参乙醇提取物（SME），并通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）进行成分分析，共鉴定出 596 种化合物。随后，研究者采用 CCK-8 实验评估 SME 的抗胃癌活性，结果显示 SME 约从 1 μg/mL 开始表现出抑制作用。
研究者注意到，SME 处理后的肿瘤细胞培养基颜色发生明显变化，因此进一步对 HGC-27 细胞经 SME 处理 24 h 后的培养基进行代谢组学分析。KEGG 富集分析显示，随着 SME 浓度升高，细胞代谢通路的富集程度最高。乳酸是重要的肿瘤代谢物，可迅速酸化细胞外环境。实验观察到，SME 可显著降低胃癌细胞的细胞外乳酸分泌。
为初步解析这一抑制机制，研究者依次补充糖酵解末端代谢中间产物。结果显示，加入丙酮酸和 PEP 可显著恢复 SME 诱导的乳酸下降，而 2-磷酸甘油酸（2-phosphoglycerate，2-PG）不能恢复。这提示，烯醇化酶催化 2-PG 转化为 PEP 的步骤，可能是 SME 发挥作用的关键环节。进一步的生物信息学分析显示，在 TCGA 数据库中，ENO1 在所有胃肠道肿瘤中均高表达，ENO2 和 ENO3 中度上调。CCLE 数据库中 17 种常用胃癌细胞系的表达谱也显示，ENO1 几乎在所有胃癌细胞系中高表达，ENO2 和 ENO3 中度表达，而 ENO4 几乎缺失。
不过，特定浓度的 SME 处理并未改变 HGC-27 和 AGS 细胞中 ENO 蛋白水平。Amplex Red 定量检测显示，SME 可显著降低胃癌细胞中的 PEP 水平。随后检测烯醇化酶活性发现，SME 处理 24 h 后，AGS 和 HGC-27 胃癌细胞中的烯醇化酶活性均显著下降。因此，SME 是一种能够调控烯醇化酶活性的有效成分来源。
图1：SME 被鉴定为烯醇化酶抑制剂。（A）SME 处理 24 h 后，通过 CCK-8 实验检测胃癌细胞活力。（B）SME 处理 24 h 后，对 HGC-27 细胞培养上清进行代谢组学分析。（C）SME 处理 24 h 后，检测胃癌细胞培养上清中的 L-乳酸含量。（D）SME 与其他代谢物共同处理胃癌细胞 24 h 后，检测乳酸含量。（E）局部乳酸代谢示意图。（F）TCGA 数据库中 ENO 家族的表达水平。（G）CCLE 数据库中胃癌细胞系的 ENO 表达情况。（H）SME 处理 24 h 后，胃癌细胞中 ENO 蛋白表达水平。（I）SME 处理 24 h 后，通过 Amplex Red 实验检测胃癌细胞中的 PEP 含量。（J）SME 处理 24 h 后检测 ENO 酶活性。原图中出现 ns、、、 等统计学标记；按全文统计学方法，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示无统计学意义。
CTS 被鉴定为靶向 ENO1 的烯醇化酶抑制剂
为寻找具有 ENO 抑制活性的潜在化合物，研究者从 PubChem 获取了 458 种具有明确三维结构的化合物。利用基于蛋白结构的反向筛选技术，研究者以 ENO1 二聚体的催化口袋作为对接中心，计算每种化合物与该口袋的亲和力。结果显示，Neoprzewaquinone A 和 Isoginkgetin 具有最高亲和力。最终，研究者根据最高对接得分、最高含量得分，或对接得分与含量得分综合排序较高等标准，选择 6 种化合物进行验证。
在 HGC-27 细胞低毒性浓度条件下，隐丹参酮（CTS）和丹参酮 I 对乳酸分泌的抑制最为明显。既往研究提示 CTS 可降低肿瘤细胞糖酵解，但未明确涉及烯醇化酶。因此，研究者进一步聚焦 CTS 介导糖酵解抑制的具体机制。
通过有限蛋白酶解蛋白质组学，研究者鉴定了可能与 CTS 直接结合的蛋白靶点。其中，3 条 ENO1 肽段和 1 条 ENO2 肽段显著上调，引起研究者关注。随后，纯化 ENO1 蛋白与 CTS 的 SPR 分析显示二者可有效结合，稳态亲和力拟合得到解离常数为 31.5 μM。细胞热转移实验（cellular thermal shift assay，CETSA）和药物亲和响应靶标稳定性实验（DARTS）进一步证明了 CTS 与 ENO1 的结合能力。
研究者使用 ENO1 特异性抗体从细胞裂解液中捕获 ENO1 蛋白，从而检测细胞内 ENO1 特异性酶活性。结果显示，CTS 可显著降低 AGS 和 HGC-27 胃癌细胞中的 ENO1 活性。随后，研究者在 AGS 细胞中敲低 ENO1 蛋白水平。与野生型细胞相比，在 ENO1 缺失的 AGS 细胞中，CTS 对乳酸生成的抑制作用显著减弱，同时其对总烯醇化酶活性的抑制也下降。这些结果表明，CTS 可作为烯醇化酶抑制剂，主要通过抑制 ENO1 酶活性发挥降低乳酸生成的作用。
图2：CTS 被鉴定为烯醇化酶抑制剂。（A）基于 ENO1 结构的高通量化合物筛选。（B）不同化合物对 HGC-27 细胞乳酸分泌的抑制率。（C）LiP-MS 示意图。（D）LiP-MS 鉴定到的 ENO 肽段丰度统计。（E–F）ENO1 与 CTS 之间的 SPR 分析。（G）基于 AGS 细胞裂解液的 CETSA 和 DARTS 实验。（H，I）CTS 处理 24 h 后，检测胃癌细胞中的 ENO1 酶活性。（J）AGS 细胞中敲低 ENO1 表达后的 Western blot 图像。（K）检测 ENO1 敲低 AGS 细胞培养上清中的乳酸水平。（L）检测 ENO1 敲低 AGS 细胞裂解液中的烯醇化酶活性。原图中包含 ns、、* 及具体 P 值等统计学标记。
CTS 抑制胃癌细胞恶性表型
研究者首先通过 CCK-8 实验评估 CTS 对胃癌细胞的抑制作用。结果显示，CTS 对 AGS 和 HGC-27 细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为 11.88 μM 和 17.92 μM。胃癌细胞暴露于特定浓度 CTS 24 h 后，增殖能力显著下降。同时，CTS 明显降低胃癌细胞中增殖标志物 Ki67 和 PCNA 的表达。
CTS 对胃癌细胞的促凋亡作用主要出现在较高浓度持续暴露条件下。在 4–8 μM 浓度范围内，胃癌细胞凋亡率约为 5%–10%；而 16 μM CTS 可显著增加凋亡。同时，CTS 暴露诱导凋亡标志物 Caspase-3 剪切，提示凋亡通路被启动。通过无标记延时成像，研究者在 12 h 内追踪细胞运动轨迹，发现 CTS 可显著抑制胃癌细胞迁移，且这一效应在给药后较快出现。
随后，研究者将 AGS 和 HGC-27 细胞形成的肿瘤球嵌入三维基质胶中，并进行 72 h 延时成像，以观察其侵袭表型。结果显示，CTS 以浓度依赖方式显著抑制胃癌细胞在基质胶中的侵袭能力。这些结果表明，CTS 可抑制胃癌细胞的多种恶性表型。
图3：CTS 抑制胃癌中的恶性表型。（A）CTS 处理 24 h 后，通过 CCK-8 实验检测胃癌细胞活力。（B）CTS 处理 24 h 后，通过 EdU 实验检测细胞增殖；原图显示 DAPI、EdU 和 Merge 通道。（C）细胞增殖标志物的 Western blot 图像。（D）CTS 处理 24 h 后，通过流式细胞术检测胃癌细胞凋亡；原图标注 Annexin V-FITC 和 PI 通道。（E）凋亡标志物的 Western blot 图像。（F）使用高内涵实时成像系统追踪 12 h 的细胞运动轨迹。（G）通过三维侵袭实验评估胃癌细胞侵袭表型。原图中包含 ns、、* 等统计学标记。
CTS 通过抑制乳酸影响胃癌细胞功能
进一步实验确认，CTS 可剂量依赖性抑制胃癌细胞乳酸生成。与此同时，向培养基中加入适当浓度的外源性 L-乳酸可增强胃癌细胞活性。含 15 mM 乳酸的培养基在室温下 pH 为 5.94。随后，研究者使用盐酸将培养基 pH 调整至 5.9。在该条件下培养细胞 24 h，会轻度损伤胃癌细胞活力。因此，外源性乳酸引起的促增殖作用主要来自乳酸本身，而不是由细胞外酸性环境介导。
糖酵解压力测试显示，CTS 可剂量依赖性显著抑制胃癌细胞的细胞外酸化率。进一步分析发现，CTS 显著抑制胃癌细胞的基础糖酵解和最大糖酵解能力，但对糖酵解储备影响不明显。随后研究者发现，在 CTS 处理的胃癌细胞中加入乳酸，可恢复其增殖能力。这些结果提示，CTS 抑制胃癌细胞的能力可能与其抑制乳酸生成的特性相关。
图4：CTS 通过乳酸抑制胃癌细胞。（A）CTS 处理 24 h 后，检测胃癌细胞培养基中的乳酸水平。（B）加入不同浓度外源性乳酸 24 h 后，通过 CCK-8 实验检测胃癌细胞活力。（C–D）CTS 处理 24 h 后，通过 Seahorse 系统检测细胞外酸化率。（E–F）胃癌细胞中乳酸与 CTS 共同处理 24 h 后，通过 EdU 实验检测细胞增殖率；原图显示 DAPI、EdU 和 Merge 通道。原图中包含 ns、、、 等统计学标记。
CTS 抑制异种移植瘤和患者来源类器官生长
为评估 CTS 在体内抑制胃癌生长的潜力，研究者使用 HGC-27 细胞建立异种移植瘤模型。结果显示，CTS 可剂量依赖性减缓肿瘤生长。值得注意的是，高浓度 CTS 对胃癌的治疗效果仅略低于阳性对照药物顺铂。肿瘤生长曲线显示，CTS 在开始给药后即对胃癌进展产生抑制作用。同时，CTS 显著增加异种移植瘤中凋亡标志物 Cleaved Caspase-3 的表达，并降低增殖标志物 Ki67 的表达，说明 CTS 可在体内抑制胃癌进展。
随后，研究者对中剂量组和高剂量组小鼠的重要器官进行 HE 染色，并由专业病理学医师评估。结果显示，CTS 处理后小鼠器官未见明显病理改变。给药最后一天检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，未观察到显著变化。血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）水平也未发生明显改变。这些发现提示，治疗浓度下的 CTS 未在小鼠中诱导明显毒理学反应。
图5：CTS 抑制异种移植瘤生长。（A）解剖后的异种移植瘤图像；原图中可见 2 cm 标尺。（B–C）小鼠肿瘤体积和肿瘤重量统计。（D）肿瘤免疫组织化学图像，检测 Cleaved Caspase-3 和 Ki67。（E）CTS 处理两周后，采集小鼠重要器官并进行 HE 染色。（F–G）CTS 处理两周后，采集小鼠血清并分析多项生化指标；图中还包括 BUN 和 CREA 水平检测。原图中包含 、、 等统计学标记。
为了更好评估 CTS 在人源肿瘤中的潜力，研究者建立了来自胃体腺癌患者的人源胃癌类器官。该患者分期为 T4aN2M1。研究者通过延时成像监测患者来源类器官在不同药物暴露 72 h 内的变化。结果显示，CTS 以剂量依赖方式抑制 PDOs 生长，在高浓度组可观察到类器官凋亡。研究者还发现，乳酸可促进类器官生长；关键的是，补充乳酸可恢复 CTS 对 PDOs 的抑制作用。CTS 还降低类器官向培养基中分泌乳酸，进一步证实其作为乳酸抑制剂的作用。
第二个类器官来自同源重组修复缺陷型胃癌，携带 ATM 和 ATR 突变，分期为 T4aN+M1。病理检查显示其为印戒细胞癌，并呈现葡萄样生长模式。与 10 μM 顺铂相比，CTS 对该类器官显示出更强的抑制作用。乳酸添加明显促进该类器官生长，并可恢复被 CTS 抑制的生长。同时，CTS 也抑制该类器官的乳酸生成。由于其生长形态不规则，研究者未测量该类器官直径。
第三个珍珠样类器官来自一名 T4aN+M1 患者，并具有 HER2 阳性分子特征。CTS 显著抑制其生长，其中 16 μM CTS 的抑制效果与 10 μM 顺铂相当。CTS 在抑制乳酸生成方面也表现出较强效应。总体来看，这些结果说明 CTS 可抑制患者来源类器官生长，而这一作用与乳酸抑制相关。
图6：CTS 抑制患者来源类器官生长。（A）患者来源胃癌类器官的实时监测图像；对胃癌类器官大小和活性进行评估；CTS 处理 72 h 后，检测类器官培养基中的乳酸含量。（B–C）患者来源胃癌类器官的实时监测图像；对胃癌类器官大小和活性进行评估；CTS 处理 72 h 后，检测类器官培养基中的乳酸含量。原图中包含 Ctrl、CTS、DDP、Lac、CTS+Lac 等处理组，以及 ns、、、 等统计学标记。
CTS 作为 ENO1 的变构调节剂发挥作用
已有研究提示，烯醇化酶的活性单位是二聚体而非单体。为阐明 CTS 通过 ENO1 抑制糖酵解的具体机制，研究者利用 AlphaFold 2 构建 ENO1、ENO2 和 ENO3 的同源二聚体。分子对接分析显示，CTS 可与 ENO1、ENO2 和 ENO3 二聚体形成明确复合物。值得注意的是，其结合位点位于烯醇化酶二聚体形成的裂隙中，该区域构成酶的催化口袋。
随后，研究者以 ENO1 为代表进行 200 ns 分子动力学模拟。每 1 ns 叠加一次分子构象图，结果显示构象整体较为一致，提示 CTS 可与 ENO1 形成稳定复合物。均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）分析显示，CTS 和 ENO1 在 60 ns 后逐渐进入稳定平台期，说明体系达到热力学平衡，CTS-ENO1 复合物处于稳定状态。均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）用于评估模拟过程中氨基酸残基原子坐标波动。绝大多数模拟时间内 RMSF 值低于 0.2 nm，提示复合物柔性较低、构象稳定。同时，ENO1 的二级结构在模拟过程中未发生明显变化。后续自由能分析显示，体系形成明显能量簇，提示存在有利结合区域。
将 ENO1 天然底物 2-PG 的分子构象投射到其结合口袋后发现，CTS 与 2-PG 之间并无明显空间竞争，唯一潜在相互作用可能涉及 Arg32。随后，在 HGC-27 细胞裂解液样本中外源性加入高浓度 2-PG，结果显示 CTS 与 2-PG 之间存在复杂竞争动力学曲线。低浓度 CTS 时，曲线表现出非竞争性特征；高浓度 CTS 时，则表现出竞争性动力学特征。这种复杂动力学曲线可能源于 CTS 与 Arg32 结合后降低 ENO2 对 2-PG 的亲和力，从而呈现竞争性动力学表现。然而，此处使用的 CTS 浓度远高于细胞暴露水平，因此研究者认为 CTS 对 ENO 活性的抑制主要通过变构调控实现。
最后，为判断 CTS 与 ENO1 结合是否依赖 Thr379 位点，研究者构建了 ENO1 T379A 突变体。他们在无细胞蛋白表达系统中表达 His-ENO1 T379A，并通过钴柱色谱纯化蛋白。SPR 分析显示，ENO1 T379A 与 CTS 的解离常数为 164.4 μM，结合强度下降约 5 倍。这些结果说明，ENO1 的 Thr379 是其与 CTS 相互作用的关键氨基酸。
图7：CTS 作为 ENO1 的变构调节剂发挥作用。（A）ENO1、ENO2 和 ENO3 同源二聚体与 CTS 的分子对接。（B）分子动力学模拟过程中 200 个构象的叠加图像。（C–D）动力学模拟的 RMSD 和 RMSF 分析。（E）蛋白二级结构分析。（F）动力学模拟过程中结合能的三维可视化。（G）CTS 和 2-PG 在 ENO1 二聚体结合口袋中的位置和构象。（H）CTS 与 2-PG 的竞争动力学曲线。（I）纯化 ENO1 T379A 的考马斯亮蓝染色凝胶。（J–K）ENO1 T379A 与 CTS 的 SPR 分析。
CTS 抑制组蛋白 H3 乳酰化
近期研究显示，蛋白赖氨酸乳酰化在肿瘤进展中具有重要作用，尤其与转录调控密切相关。研究者发现，CTS 可显著抑制 AGS 细胞中全局赖氨酸乳酰化水平，这可能与乳酸含量降低直接相关。值得注意的是，在约 15 kDa 处可观察到一条明显乳酰化条带，并且该条带被 CTS 显著下调。研究者使用考马斯亮蓝染色定位该条带，并对该位置凝胶进行蛋白质组学分析，结果检测到组蛋白 H3 肽段，且其在凝胶中丰度较高。
鉴于组蛋白 H3 第 9、14 和 18 位点乳酰化在肿瘤发生中具有重要作用，研究者进一步检测 CTS 对这些位点乳酰化的影响。结果显示，CTS 以剂量依赖方式降低 H3K9 和 H3K18 乳酰化水平，其中 H3K18 位点下降最为明显。与此一致，在接受 30 mg/kg CTS 处理的异种移植瘤中，H3K18la 水平也下降。
p300 被认为参与 H3K18la 的“写入”，而 HDAC2 参与其“擦除”。本研究发现，CTS 并未改变 p300 与 H3 之间的相互作用。胃癌细胞中 H3K18la 的降低大约需要 CTS 暴露 6 h。因此，研究者检测了 AGS 细胞暴露于 CTS 3 h 后，HDAC2 与 H3K18la 蛋白之间的相互作用。结果显示，CTS 显著增加 HDAC2 与 H3K18la 的结合。
鉴于 PEP 被报道为 HDAC1 抑制剂，研究者推测 PEP 也可能与 HDAC2 结合，并抑制其去乳酰化活性。分子对接结果显示，PEP 可直接结合 HDAC2，并形成两个稳定氢键。随后，研究者模拟 HDAC2-H3 复合物构象，发现二者之间具有广泛而稳定的结合界面，结合能为 -22.9 kcal/mol。值得注意的是，PEP 与 HDAC2 的结合位点位于该界面中，并占据部分空间。该结果提示，PEP 可能作为 HDAC2 去乳酰化活性的抑制剂发挥作用。
因此，研究者提出 CTS 对组蛋白 H3 乳酰化具有双重抑制作用：一方面，CTS 降低乳酸水平，从而减少总体乳酰化；另一方面，CTS 降低 PEP 水平，从而增强 HDAC2 介导的 H3K18la 去乳酰化。
图8：CTS 抑制组蛋白 H3 乳酰化。（A）HGC-27 细胞经 CTS 处理 24 h 后，泛乳酸修饰蛋白的 Western blot 图像及对应考马斯亮蓝染色凝胶。（B）凝胶 15 kDa 位置处组蛋白 H3 的二级质谱图。（C）组蛋白 H3 第 9、14 和 18 位点修饰的 Western blot 图像。（D）异种移植瘤中 H3K18la 的免疫组织化学图像，比例尺：50 μm。（E）不同条件下 p300 与组蛋白 H3 的共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）图像。（F）不同 CTS 处理时间后 H3K18la 的 Western blot 图像。（G）不同条件下 HDAC2 与 H3K18la 的共免疫沉淀图像。（H）HDAC2 与 PEP 的分子对接图像。（I–J）HDAC2 与组蛋白 H3 的分子对接图像。（K）PEP 与 HDAC2 的结合位点位于 H3 和 HDAC2 之间的界面处。
H3K18la 降低通过下调 MGAT4A 抑制葡萄糖摄取
为研究 H3K18la 下降所调控的转录过程，研究者使用 H3K18la 抗体对 HGC-27 细胞进行 Cut&Tag 分析。结果显示，在 CTS 处理细胞中，第 18 位点乳酰化的 H3 蛋白在转录起始位点（transcription start site，TSS）区域的富集显著降低。在正常条件下，乳酰化 H3 蛋白主要定位于内含子、远端基因间区、启动子和外显子区域。
进一步分析 CTS 对启动子区域乳酰化 H3 富集的调控后，MGAT4A 的显著下调引起研究者关注。整合基因组浏览器（IGV）可视化结果显示，CTS 干预后 MGAT4A 位点的 H3K18la 富集广泛下降。TCGA 数据库分析显示，MGAT4A 在多数肿瘤中高表达，尤其是在急性髓系白血病（LAML）、胃腺癌（STAD）和胸腺瘤（THYM）中更为明显。MGAT4A 已知可通过糖酵解促进肿瘤进展，并与葡萄糖转运蛋白 GLUT1 的细胞膜定位相关。
研究者首先通过 Western blot 确认，CTS 可降低胃癌细胞中 MGAT4A 表达。免疫荧光结果显示，CTS 处理 24 h 后，GLUT1 在细胞膜上的定位减少，同时细胞质中 MGAT4A 表达下降。类似结果也在异种移植瘤中观察到：在 CTS 处理的肿瘤区域中，MGAT4A 低表达区域伴随 GLUT1 细胞膜定位受损。由于 GLUT1 的膜表达对葡萄糖摄取功能至关重要，研究者随后发现，CTS 可剂量依赖性减少胃癌细胞对葡萄糖类似物 2-NBDG 的摄取，提示细胞葡萄糖摄取受到抑制。
进一步地，研究者建立了外源性表达 MGAT4A 的胃癌细胞系。当这些细胞暴露于 CTS 后，外源性 MGAT4A 表达可部分恢复胃癌细胞的葡萄糖摄取。以上结果表明，CTS 通过降低 MGAT4A 表达并减少 GLUT1 细胞膜定位，抑制胃癌细胞葡萄糖摄取。
图9：H3K18la 降低通过减少 MGAT4A 表达抑制葡萄糖摄取。（A）TSS 区域 H3K18la 富集图。（B）H3K18la 在不同 DNA 区域中的富集比例。（C）CTS 处理前后 DNA 区域中 H3K18la 差异富集的火山图。（D）MGAT4A 的 IGV 可视化结果。（E）TCGA 数据库中不同肿瘤类型的 MGAT4A 表达水平分析。（F）CTS 处理 24 h 后 MGAT4A 表达的 Western blot 图像。（G）CTS（8 μM）处理 24 h 后，MGAT4A 和 GLUT1 的免疫荧光图像；原图显示 DAPI（蓝色）、MGAT4A（绿色）、GLUT1（红色）和 Merge 通道。（H）异种移植瘤免疫荧光图像，比例尺：25 μm；原图显示 DAPI（蓝色）、MGAT4A（红色）、GLUT1（绿色）和 Merge 通道。（I）CTS 处理 24 h 后，胃癌细胞对葡萄糖类似物 2-NBDG 的葡萄糖摄取率。（J）CTS 暴露 24 h 后，过表达 MGAT4A 的胃癌细胞系的 Western blot 图像。（K）采用 2-DG 方法进行葡萄糖摄取实验。原图中包含 、* 等统计学标记。
【贡献】★★★★★
总之，本研究较系统地评估了 CTS 在胃癌中抑制组蛋白 H3 乳酰化的作用及机制，并通过多种技术手段进行了验证。研究结果支持 CTS 可作为调控乳酸和乳酰化的有效分子工具，也可能为传统中药丹参的进一步临床应用提供更多机制依据。需要注意的是，本文研究主要基于胃癌细胞、异种移植瘤和患者来源类器官等模型，其结果仍属于机制和前临床层面的证据，不能直接等同于临床治疗效果。
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