2026年7月23日，福建医科大学药学院姚宏团队，联合福建农林大学蜂学与生物医药学院史培颖团队、福建医科大学基础医学院胡芬团队等，在Phytomedicine（中科院1区，IF=11.3）以 Journal Pre-proof 形式发表题为 “Tanshinone IIA attenuates myocardial ischemia by targeting FGFR1 residue Gln284 for allosteric modulation and subsequent autophagy inhibition” 的研究论文。该文于2025年12月30日投稿，2026年6月29日修回，2026年7月22日接收。Phytomedicine 最新期刊指标显示 Impact Factor 为11.3，JCR分区为Q1。
心肌缺血（myocardial ischemia，MI）是缺血性心脏病的重要病理基础。丹参酮IIA（Tanshinone IIA，Tan IIA）是传统中药丹参中的主要活性成分之一，其磺酸钠制剂已用于缺血性心脏病治疗，但其直接分子靶点和精确机制仍不完全清楚。该研究通过小鼠心肌缺血模型、人源GEO数据集挖掘、网络药理学、分子对接、磷酸化蛋白质组学、CETSA、DARTS、BLI、分子动力学模拟和位点突变等策略，鉴定出成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）是Tan IIA的直接作用靶点。
研究发现，Tan IIA可直接结合FGFR1蛋白Gln284残基，促进FGFR1 Y653/Y654位点反式自磷酸化，并激活下游FRS2-MAPK及AKT/mTOR相关信号，从而抑制心肌细胞异常自噬并减轻心肌缺血损伤。该研究将Tan IIA从“多靶点天然产物”的经验性理解，推进到“FGFR1胞外结构域导向的变构调节剂”这一更明确的分子机制层面。
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【摘 要】
背景：心肌缺血（MI）可导致多种病理损伤，药物干预仍是重要治疗策略。丹参酮IIA（Tan IIA）是传统中药丹参中的主要活性成分之一，其磺酸钠形式，即丹参酮IIA磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulfonate，STS），已在临床用于缺血性心脏病治疗。然而，Tan IIA发挥作用的精确分子机制和直接靶点仍未完全阐明。
目的：本研究旨在从体内和体外两个层面探索Tan IIA抗MI的作用靶点和分子机制。
方法：研究建立了左前降支结扎（left anterior descending artery ligation，LADL）和异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的小鼠MI模型，用于验证Tan IIA对MI的干预作用。随后，研究者重新分析人心脏组织GSE1145数据集，并整合网络药理学、分子对接和磷酸化蛋白质组学，筛选Tan IIA潜在靶蛋白。随后通过基因敲低模型，以及细胞热转移实验（cellular thermal shift assay，CETSA）、药物亲和反应靶标稳定性实验（drug affinity responsive target stability，DARTS）、生物层干涉技术（biolayer interferometry，BLI）和分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟等多种方法验证Tan IIA与靶点之间的亲和力。
结果：FGFR1被鉴定为Tan IIA的新靶点。结合实验显示，Tan IIA与FGFR1存在特异性相互作用，解离常数为13.8 μM。定点突变进一步证明，Tan IIA可直接结合FGFR1的Gln284残基，并促进Y653/Y654位点反式自磷酸化。机制上，Tan IIA激活下游FRS2-MAPK通路以抑制自噬；而体外酶学实验提示，其同时会限制激酶结构域的催化周转。上述独特调节模式使Tan IIA表现为一种靶向胞外结构域的变构调节剂，可将受体磷酸化与稳态酶通量部分解偶联，从而提供心肌保护作用。
结论：本研究鉴定FGFR1为Tan IIA的直接分子靶点，建立了其心肌保护作用的靶点特异性机制，并为MI精准治疗策略开发提供了机制基础。
01
研究背景及科学问题
心肌缺血是一种因冠状动脉粥样硬化或栓塞等因素导致心脏血液灌注减少的病理状态。其结果是心肌供氧不足、心肌能量代谢异常，无法继续支持正常心脏功能。MI过程中，心肌处于缺血缺氧状态，心肌细胞线粒体功能受损并出现细胞内钙超载，进一步导致心肌细胞坏死。这一过程可能触发一系列缺血性心脏事件，包括心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病甚至心源性猝死。药物治疗仍是MI干预的重要方式。
在临床实践中，含丹参的单味或复方中药制剂常用于MI相关心血管疾病。Tan IIA是一种脂溶性丹参酮，被认为是丹参抗MI的重要活性成分，在改善MI以及心肌梗死后心脏免疫微环境异常重塑方面具有治疗潜力。MI的病理进展常伴随严重线粒体功能障碍和异常自噬，因此，将系统药效学评价与线粒体功能和自噬状态评估结合起来，对于全面阐明这类药物干预的保护机制至关重要。
已有证据显示，Tan IIA可通过调控多条信号通路和潜在靶点减轻心肌损伤。例如，它可通过与特定蛋白相互作用发挥抗凋亡和抗氧化作用。然而，尽管Tan IIA已被证明可调节多种信号通路，目前仍缺乏基于直接靶点结合实验的系统研究来定义其直接结合靶点。这一知识缺口遮蔽了其复杂药效机制，也限制了其在临床精准用药中的进一步应用。因此，明确Tan IIA的直接结合靶点具有重要科学意义。
本研究围绕Tan IIA抗MI作用的靶点和机制展开。为增强靶点解析策略的可靠性，研究者将整体研究框架置于化学蛋白质组学的大背景下。虽然活性基团蛋白质组学和光亲和标记等技术代表了直接靶点鉴定的前沿方法，但将人类临床数据与经典生物物理验证相结合，也能提供稳健且具有功能相关性的替代路径。基于这一整合策略，研究者首先分析GEO数据库中的GSE1145数据集，该数据集包含11例健康对照和25例缺血诱导心肌病患者的人心脏组织。随后，研究进一步结合临床数据挖掘、网络药理学、分子对接，以及Tan IIA干预叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）损伤H9c2心肌细胞后的磷酸化蛋白质组学分析，最终鉴定FGFR1为介导抗MI保护作用的主要靶蛋白。
为进一步确认药物与FGFR1之间的直接结合亲和力，研究者使用受体敲低细胞系，并结合CETSA、DARTS、BLI和MD模拟等多种靶点稳定性与结合验证技术。随后，Western blot和免疫荧光用于功能性验证下游信号级联反应；定点突变进一步证明，Tan IIA可直接结合FGFR1的Gln284残基。
02
重要发现及亮点
Tan IIA减轻MI模型小鼠心肌损伤
为验证Tan IIA对MI的治疗作用，研究者建立了两种小鼠MI模型：LADL诱导模型和ISO诱导模型。LADL模型中，心电图ST段显著抬高，血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和炎症标志物C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）升高，提示MI模型建立成功；10 mg/kg Tan IIA干预后，上述指标恢复至接近对照组水平。虽然Tan IIA腹腔注射未显著逆转MI模型小鼠心脏重量/体重比的升高，但Masson染色显示，其可减少缺血心肌组织中胶原纤维广泛沉积；麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色进一步显示，缺血心肌中增大的心肌细胞面积和紊乱排列在治疗组中明显改善。
在ISO诱导心肌损伤模型中，ISO给药后1 h出现明显T波倒置，证实模型建立成功。第7天时，模型组和治疗组心电图波形均出现一定恢复。与模型组相比，不同Tan IIA给药组以及阳性药普萘洛尔组的纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）均显著下调，提示Tan IIA具有一定抗凝作用；但活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）仅在高剂量组下降。Masson、H&E和Sirius Red染色显示，低剂量（5 mg/kg）和中剂量（10 mg/kg）Tan IIA可减轻心脏组织水肿和胶原沉积，而高剂量（15 mg/kg）治疗效果略弱。整体来看，Tan IIA抗MI药效具有剂量相关性，合适剂量如5和10 mg/kg可有效减轻小鼠MI损伤。
图1：Tan IIA减轻LADL和ISO诱导的小鼠MI损伤。（A）构建ISO和LADL诱导的MI模型，并设定Tan IIA及阳性药给药方案。（B-C）Tan IIA处理后LADL小鼠血清cTnI水平（B）和炎症因子CRP水平（C）（n=5-6）。（D）各组小鼠心脏重量/体重比（n=6）。（E）各组心脏组织切片Masson染色（n=3）。比例尺：1000 μm或50 μm。（F）各组心脏组织切片WGA染色（n=3）。比例尺：100 μm。（G）ISO诱导MI模型小鼠在不同浓度Tan IIA处理组及阳性药PR组中的血清凝血指标水平（n=4-6）。（H）ISO诱导MI模型小鼠不同组别心脏组织切片Masson染色、HE染色和Sirius Red染色（n=3）。比例尺：500 μm或50 μm。B-D和G数据以均值±SEM表示。统计学分析采用单因素方差分析并进行Dunnett校正。*p < 0.05，**p < 0.01，# < 0.01；ns表示无显著性差异。
基于人类数据挖掘、靶点捕获和分子对接筛选Tan IIA抗MI潜在靶点
为建立连接人类疾病生物学和药物靶点发现的系统性假设生成框架，研究者设计了整合生物信息学策略来筛选高可信靶点。候选靶点需满足两个标准：其一，在人MI相关心脏组织中差异表达，具备较强病理相关性；其二，计算预测可与Tan IIA发生相互作用，支持其可靶向性。通过这一双重筛选策略，研究者将大量潜在蛋白收敛至具有疾病相关性和药物结合潜力的主要治疗候选靶点。
研究整合了人心脏组织GSE1145数据集，包括11例健康对照和25例缺血性/肥厚型心肌病患者样本。UMAP可视化显示组间存在明显异质性。差异表达分析共识别出7921个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。这些DEGs与GeneCards中整理的1267个MI相关蛋白取交集，其中包括322个下调基因和123个上调基因。疾病本体（Disease Ontology，DO）富集显示，“左心室肥厚”是最显著富集的条目，进一步将候选靶点缩小至141个。随后，这141个候选靶点与Tan IIA靶点捕获预测所得254个潜在靶点取交集，最终得到19个高概率Tan IIA相互作用靶点。分子对接进一步将FGFR1排序为最佳结合对象，显示Tan IIA可通过FGFR1 Gln284位点形成1.9 Å氢键。
考虑到初始发现数据集GSE1145存在时间和平台限制，研究者进一步引入GSE116250这一更新的RNA测序临床队列进行独立验证。ROC曲线分析显示，FGFR1对缺血性心肌病具有较高诊断价值，AUC为0.879，提示其可能是较稳健的临床生物标志物。进一步单基因GSEA分析显示，FGFR1表达与心肌梗死后重塑相关事件广泛正相关，包括细胞外基质组织、血管生成、细胞-基质黏附和趋化；同时与DNA复制、染色体分离和DNA双链断裂修复等细胞周期及DNA维持过程负相关。针对自噬相关通路的单基因GSEA还显示，FGFR1表达与“线粒体自噬调控”显著正相关，与“微自噬”显著负相关。这些临床验证结果支持靶向FGFR1治疗缺血性心肌病的潜在价值。
图2：FGFR1是Tan IIA抗MI的潜在蛋白靶点。（A）结合疾病数据库和分子对接筛选潜在Tan IIA结合蛋白的策略流程图。（B）GSE1145数据集分析显示MI相关样本分组情况。（C）统一流形近似与投影图显示样本组别的聚类结构。（D）疾病数据库筛选所得1267个候选蛋白在患者组与对照组之间的火山图，其中322个基因下调、123个基因上调。（E）1267个候选蛋白的DO富集分析，排名最靠前的条目包含141个富集蛋白。（F）Tan IIA靶点捕获结果中的254个潜在靶点与上述141个富集蛋白取交集后得到19个潜在靶点，并进行PPI网络分析，其中包括成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）等。（G）Tan IIA与FGFR1 Gln284位点结合结构的可视化，显示有利氢键长度为1.9 Å。（H）受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估FGFR1在独立验证队列GSE116250中的诊断价值。（I）单基因基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）图显示FGFR1表达与特定自噬过程之间的相关性。结果显示，FGFR1与“线粒体自噬调控”显著正相关，与“微自噬”显著负相关。
磷酸化蛋白质组学进一步提示FGFR1是Tan IIA抗MI关键靶点
为进一步探索Tan IIA靶点，研究者在t-BHP损伤H9c2细胞并经Tan IIA干预后，进行TMT标记磷酸化定量蛋白质组学分析。PCA和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果提示各组具有良好重复性和平行性。模型组与Tan IIA组之间差异修饰蛋白主要分布于细胞核，其次为细胞质和质膜。t-BHP模型造成细胞氧化应激，并破坏蛋白结构和活性，导致蛋白损伤。火山图和热图显示模型组与Tan IIA组之间的差异表达蛋白，其中多数与Rap1信号通路相关。
富集分析显示，小GTP酶结合和GTP酶活性调控等条目频繁出现在分子功能和生物过程中，而这些功能与受体酪氨酸激酶活性密切相关。在富集通路中，Rap1通路内多个MAPK级联组分磷酸化升高，包括MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3和MAP2K4。此外，FGFR1下游经典接头蛋白FRS2磷酸化显著升高，下游信号分子AKT、mTOR和SOS1磷酸化也增强。这些磷酸化蛋白质组学变化提示，Tan IIA处理可协调激活FGFR1及其相关细胞内信号模块，尤其是FGFR1已知效应分支Rap1-MAPK轴。Sankey图进一步将FGFR1激活与Rap1和MAPK通路关键组分磷酸化连接起来，突出FGFR1作为连接Tan IIA与广泛细胞内信号传播的中心节点。在两种MI小鼠模型中，Tan IIA均诱导FGFR1 Y653/Y654位点磷酸化，为FGFR1作为Tan IIA抗MI靶点提供了初步验证。
图3：Tan IIA预处理后的磷酸化蛋白质组分析及靶蛋白探索。（A）模型组采用200 μM t-BHP处理诱导H9c2心肌细胞损伤，治疗组在t-BHP损伤前给予Tan IIA预处理4 h。（B）模型组与治疗组之间差异表达蛋白火山图。（C）三组差异表达蛋白热图。（D）对模型组和治疗组差异表达蛋白进行分子功能和生物过程富集分析。（E）三组中MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3和MAP2K4蛋白的磷酸化水平。（F）三组中AKT1、FRS2和SOS1蛋白的磷酸化水平。（G）三组中mTOR蛋白的磷酸化水平。（H）Sankey图展示FGFR1调控的信号通路。（I）采用Western blot分析ISO诱导MI小鼠心脏组织中FGFR1和p-FGFR1蛋白水平（n=3），PR作为阳性药。（J）采用Western blot分析LADL诱导MI小鼠心脏组织中FGFR1和p-FGFR1蛋白水平（n=3）。I-J数据以均值±SEM表示。统计学分析采用Student’s t检验。*p < 0.05，**p < 0.01；ns表示无显著性差异。
Tan IIA调控MI小鼠中FGFR1下游Rap1、MAPK和AKT信号通路
研究进一步在MI动物模型中通过Western blot验证Tan IIA对FGFR1下游Rap1、MAPK和AKT信号通路的调控作用。在ISO诱导MI模型中，ISO降低Ras和Rap1蛋白相对表达，而PR和Tan IIA处理显著提高Rap1表达。仅高剂量Tan IIA（15 mg/kg）显著增加Rap1通路相关蛋白SOS1、Ras和Rap1表达。JNK、p38、AKT和ERK总蛋白表达在模型组、PR组和Tan IIA组之间无明显差异；ISO降低p-JNK表达并升高p-p38表达，而只有高剂量Tan IIA进一步提高JNK和p38磷酸化水平。
AKT、BRAF和ERK总蛋白在各组之间保持稳定，但MI模型组p-ERK和p-BRAF水平低于对照组；PR以及5、10、15 mg/kg Tan IIA处理均使其恢复至对照组水平。ISO未诱导AKT或p-AKT明显改变，但15 mg/kg Tan IIA显著升高p-AKT水平。在LADL诱导MI小鼠中，免疫荧光进一步显示，Tan IIA组心脏组织中Y654位点磷酸化p-FGFR1表达显著高于模型组。这些结果提示，Tan IIA可靶向FGFR1并调节Y654位点磷酸化，从而调控MI小鼠中的MAPK和AKT等下游信号通路。值得注意的是，低剂量和中剂量Tan IIA更有助于使MI小鼠心肌细胞MAPK和AKT信号传导恢复至正常生理状态，而高剂量效果较弱。
图4：小鼠模型中Tan IIA预处理后FGFR1磷酸化位点筛选及其对下游MAPK、AKT信号通路的影响。（A-B）采用Western blot分析ISO诱导MI小鼠心脏组织中SOS1、Ras、Rap1蛋白（n=3），PR作为阳性药。（C-D）采用Western blot分析ISO诱导MI小鼠心脏组织中p-JNK、JNK、p-p38、p38蛋白。（E-F）采用Western blot分析ISO诱导MI小鼠心脏组织中p-AKT、AKT、p-BRAF、BRAF、p-ERK、ERK蛋白。（G-H）采用免疫荧光分析LADL诱导MI小鼠心脏组织中FGFR1和p-FGFR1（Y654）表达（n=3）。数据以均值±SEM表示。统计学分析采用Student’s t检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示无显著性差异。
Tan IIA诱导FGFR1磷酸化并调控心肌细胞凋亡和自噬
为进一步研究Tan IIA对FGFR1的影响，研究者将Tan IIA与选择性FGFR1抑制剂PD166866联合用于竞争拮抗实验。PD166866可有效抑制FGFR1及其下游蛋白FRS2磷酸化，而0.1 μM及以上浓度Tan IIA可显著抵消PD166866的抑制作用，使FGFR1和FRS2磷酸化水平明显升高。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作为阳性对照。Tan IIA给药后p-FGFR1、p-FRS2和p-ERK蛋白变化模式与bFGF处理相似。
在H/R条件下，研究者通过Calcein-AM/PI染色和MDC染色评估细胞活力与自噬。单独给予Tan IIA或FGFR1抑制剂PD166866均可较H/R模型组改善细胞存活；Tan IIA能有效抑制H/R诱导自噬，而PD166866则增强细胞自噬过程。Tan IIA保护作用优于PD166866，二者联合并未产生协同存活获益。
在ISO诱导MI小鼠中，缺血心脏组织Bcl-2表达降低、BAX表达升高；与MI模型相比，5 mg/kg和10 mg/kg Tan IIA可逆转这些变化，而15 mg/kg高剂量Tan IIA显著降低Bcl-2/BAX比值。由此提示，低剂量和中剂量Tan IIA可抑制心肌细胞凋亡，而高剂量Tan IIA可能促进MI心脏中的细胞凋亡。在LADL模型中，Tan IIA也促进心肌细胞凋亡相关损伤恢复。
自噬相关实验进一步显示，在LADL模型心肌组织中，10 mg/kg Tan IIA维持了较强p-FGFR1和p-mTOR表达，二者呈正相关。在ISO诱导损伤模型中，cTnT荧光缺失提示缺血心肌区域；与ISO组细胞排列紊乱不同，Tan IIA治疗组心肌排列更有序。p62在心肌中显著积累，提示自噬流受扰动。氯喹阻断实验进一步表明，t-BHP可显著增强细胞自噬活性，而Tan IIA可减弱p62降解并降低LC3-II形成；即使在溶酶体降解被氯喹完全阻断的条件下，Tan IIA仍能降低LC3-II水平，说明其主要通过抑制上游自噬信号、减少自噬体形成，而不是促进自噬体降解来抑制自噬。整体来看，Tan IIA可能通过促进FGFR1磷酸化，激活下游FRS2-MAPK通路，从而抑制自噬。
图5：Tan IIA对FGFR1磷酸化水平及下游相关蛋白的影响。（A-C）AC16细胞经血清饥饿过夜后，分别给予FGFR1抑制剂PD166866、Tan IIA和bFGF处理。采用Western blot分析各组p-FGFR1和p-FRS2蛋白水平（n=3）。（D-G）检测ISO（D-E）和LADL（F-G）诱导MI模型小鼠心脏组织中Bcl2和Bax蛋白水平（n=3）。（H）LADL诱导MI小鼠心脏组织中p-mTOR和p-FGFR1免疫荧光染色。（I）ISO诱导MI小鼠心脏组织中p62和cTnT免疫荧光染色。（J-K）Western blot分析ISO诱导MI小鼠心脏组织中ANF、mTOR、p-mTOR和LC3B蛋白水平（n=3）。（L-M）Western blot检测ISO诱导MI小鼠心脏组织中FRS2、p-FRS2和GRB2蛋白水平（n=3）。数据以均值±SEM表示。统计学分析采用Student’s t检验。*p < 0.05，**p < 0.01；ns表示无显著性差异。
敲低FGFR1削弱Tan IIA对心肌细胞损伤的保护作用
研究者进一步在体外构建t-BHP损伤H9c2或AC16心肌细胞氧化应激模型，并通过MTT实验评估Tan IIA对心肌细胞的保护作用。结果显示，Tan IIA预处理4、12或24 h均可在一定程度上显著提高H9c2细胞活力，并提高受损AC16心肌细胞存活率。Tan IIA还可降低细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，抑制自噬和细胞肥大。
为验证Tan IIA药理作用是否由FGFR1介导，研究者构建了FGFR1敲低RFL-6细胞系。Western blot验证三种敲低质粒效率后，选择敲低效率最高的sh-FGFR1-2用于后续实验。MTT结果显示，FGFR1敲低削弱了Tan IIA对t-BHP损伤RFL-6细胞的保护作用。与模型组相比，0.01 μM Tan IIA无法提高sh-FGFR1细胞系活力；0.1 μM Tan IIA仍可显著提高敲低细胞存活率，但其细胞活力仍低于空载体感染细胞。这提示Tan IIA至少部分通过结合FGFR1发挥作用。
进一步检测MAPK通路关键蛋白后发现，在t-BHP诱导细胞损伤模型中，Tan IIA预处理后相对于模型组升高的p-ERK表达，在FGFR1敲低后被取消；LC3-II水平也不再较模型组下降。类似地，在ISO诱导细胞肥大模型中，FGFR1敲低逆转了Tan IIA抑制细胞肥大的能力。研究者还测试STS，发现STS对细胞肥大的抑制作用同样在sh-FGFR1细胞中消失。这些结果说明，FGFR1是Tan IIA调控细胞自噬的重要靶点。
图6：FGFR1敲低部分削弱Tan IIA的作用效力。（A-C）H9c2细胞经t-BHP处理2 h诱导心肌损伤，不同浓度Tan IIA分别预处理4、12和24 h，并通过MTT实验检测细胞活力（n=6）。（D）AC16细胞经t-BHP处理12 h诱导心肌损伤，不同浓度Tan IIA预处理4 h，并通过MTT检测细胞活力（n=5）。（E-F）H9c2细胞经Tan IIA预处理4 h后使用PBS诱导自噬，并通过MDC染色检测细胞自噬（n=3）。比例尺：100 μm。（G）Western blot检测稳定转导三种独立FGFR1 shRNA构建体或非靶向对照载体的RFL-6细胞中FGFR1水平（n=4）。（H）MTT实验检测Tan IIA预处理后t-BHP损伤的RFL-6细胞在转染空载体或sh-FGFR1后的存活率（n=5）。（I）空载体和sh-FGFR1细胞经Tan IIA预处理4 h后，再经t-BHP诱导损伤。采用Western blot检测细胞内ERK、GRB2、RAP1和LC3B等相关蛋白水平（n=3）。（J）1 µM Tan IIA预处理4 h后经ISO处理24 h诱导细胞肥大，并通过罗丹明-鬼笔环肽染色观察Tan IIA作用效果（n=3）。比例尺：50 μm。（K）100 µM STS预处理4 h后经ISO处理24 h诱导细胞肥大，并通过罗丹明-鬼笔环肽染色观察STS作用效果（n=3）。数据以均值±SEM表示。统计学分析采用单因素方差分析并进行Dunnett校正。*p < 0.05，**p < 0.01；ns表示无显著性差异。
Tan IIA可直接结合并稳定FGFR1蛋白
为进一步验证Tan IIA与FGFR1之间的相互作用，研究者采用CETSA、DARTS、分子对接、MD模拟和BLI实验共同评估Tan IIA对FGFR1的亲和力。CETSA结果显示，Tan IIA与小鼠心肌细胞蛋白混合物孵育后，在51 °C和54 °C条件下显著维持FGFR1蛋白稳定性。H9c2细胞经Tan IIA处理后，FGFR1热稳定曲线显著右移，其稳定模式与bFGF类似。
MD模拟进一步显示，Tan IIA可改变FGFR1蛋白结构，使蛋白发生旋转，并在100 ns后稳定蛋白构象。与FGFR1单独蛋白相比，FGFR1–Tan IIA复合物表现出更低的全局最低自由能，提示其构象处于更稳定状态。RMSF结果显示，FGFR1-Tan IIA复合物在Ile256至Glu334残基区间柔性显著增加，主要与Tan IIA结合于该片段有关。RMSD结果显示，FGFR1-Tan IIA在30–50 ns内突然下降，提示Tan IIA与FGFR1结合诱导蛋白重构，使复合物趋向低能稳定结构。
在AC16细胞中，Tan IIA同样显著维持FGFR1蛋白热稳定性。DARTS实验和等温剂量反应曲线进一步支持FGFR1是Tan IIA直接靶点。BLI实验显示，Tan IIA与FGFR1蛋白的解离常数KD为13.8 µM，证实二者存在直接相互作用。值得注意的是，Tan IIA在细胞水平可诱导FGFR1下游信号磷酸化，但在使用纯化人FGFR1激酶结构域的无细胞体系中，Tan IIA对FGFR1激酶催化活性呈显著剂量依赖性抑制。研究者由此认为，Tan IIA并非简单增强激酶结构域催化效率的直接激动剂，而可能是一类新的变构构象调节剂。STS也可增强H9c2细胞蛋白混合物中FGFR1热稳定性。综合来看，FGFR1是Tan IIA或STS的直接结合蛋白，也是Tan IIA抗MI药理作用的重要靶点。
图7：Tan IIA直接结合FGFR1。（A）Tan IIA与小鼠心肌细胞蛋白直接孵育后，在51°C和54°C加热4 min，并通过Western blot检测FGFR1蛋白含量（n=4）。（B）H9c2细胞经bFGF、Tan IIA或DMSO处理后，采用Western blot分析FGFR1蛋白水平，tubulin作为上样对照（n=3）。（C）100 ns模拟过程中Tan IIA-FGFR1复合物结合稳定性和相互作用模式分析。（D-E）FGFR1（D）和Tan IIA-FGFR1复合物（E）的Gibbs自由能景观。（F）均方根涨落（root-mean-square fluctuation，RMSF）用于量化FGFR1和Tan IIA-FGFR1复合物中各氨基酸残基柔性差异。（G）均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）用于测量蛋白主链相对于初始结构的整体结构漂移，提示Tan IIA-FGFR1复合物稳定性。（H）Tan IIA与AC16细胞孵育4 h。不同温度处理后，通过Western blot分析并定量FGFR1蛋白（n=3）。（I）DARTS分析显示Tan IIA促进FGFR1抵抗蛋白酶消化。（J）向H9c2细胞蛋白混合物中加入不同浓度Tan IIA，在51°C加热4 min后，通过Western blot检测FGFR1和actin含量，并绘制等温计量曲线（n=4）。（K-L）BLI实验显示不同浓度Tan IIA与FGFR1相互作用的实时动力学结合传感图。（M）在不同浓度Tan IIA或PD166866孵育后，采用基于化学发光的实验检测FGFR1激酶活性。（N）1 µM STS与H9c2细胞蛋白溶液直接孵育，在不同温度下加热4 min，随后通过Western blot检测FGFR1蛋白含量（n=3）。
Tan IIA通过FGFR1 Gln284残基发挥结合和信号激活作用
基于分子对接和动力学模拟结果，研究者将FGFR1第284位谷氨酰胺（Gln）突变为丙氨酸（Ala），即Q284A突变。DNA测序证实该突变成功引入表达质粒。由于HEK293T细胞内源性FGFR1蛋白表达较低，转染FGFR1-WT或FGFR1-Q284A质粒后，均可显著提高可检测FGFR1蛋白水平。
FGF2可结合FGFR1，其中Gln284等残基参与配体-受体界面，并诱导受体二聚化以及酪氨酸残基自磷酸化。类似地，Tan IIA单独处理可诱导FGFR1和ERK磷酸化，模拟FGF2作用。然而，在表达FGFR1-Q284A突变体的细胞中，Tan IIA无法诱导FGFR1或ERK磷酸化。研究者还检测了FGFR1相关蛋白GRB2和LC3水平，在短期Tan IIA处理方案下，FGFR1-Q284A突变细胞中LC3I/II比值下降。综合来看，Gln284残基对于Tan IIA结合FGFR1以及随后激活下游信号通路是必需的。
图8：Tan IIA结合FGFR1 Ala284位点诱导FGFR1磷酸化。（A）使用SYBYL进行Tan IIA与FGFR1分子对接，并使用PyMOL可视化对接姿势，预测其与野生型（WT）Gln284及突变Ala284残基（Q284A）的相互作用。（B）DNA测序峰图确认FGFR1定点突变及野生型序列。（C-D）在HEK293T细胞中转染阴性对照（NC）、FGFR1-WT或FGFR1-Q284A质粒，并通过Western blot检测各组FGFR1表达水平（n=3）。（E-G）HEK293T细胞转染NC、FGFR1-WT或FGFR1-Q284A质粒并经Tan IIA（0.1 µM）处理后，p-FGFR1和p-ERK水平的代表性免疫印迹及定量分析（n=3）。（H）GRB2和LC3蛋白水平的代表性免疫印迹及定量分析（n=3）。数据以均值±SEM表示。统计学分析采用Student’s t检验。*p < 0.05；ns表示无显著性差异。
机制示意图总结
总体而言，该研究提出：人类MI数据库转录组分析首先将FGFR1识别为关键治疗靶点；Tan IIA随后被证明可直接结合FGFR1，并通过靶向Q284残基发挥具有“催化受限”特征的变构激动作用。Tan IIA诱导FGFR1磷酸化，触发下游FRS2-MAPK和AKT/mTOR信号通路，进而抑制心肌细胞异常自噬，最终减轻心脏损伤。
图9：本研究的主要发现。人类MI数据库转录组分析鉴定FGFR1为关键治疗靶点。Tan IIA直接结合FGFR1，通过靶向Q284残基发挥具有催化限制特征的变构激动剂作用，并诱导FGFR1磷酸化，触发下游FRS2-MAPK和AKT/mTOR信号通路，从而抑制心肌细胞自噬并随后减轻心脏损伤。
【贡献】★★★★★
本研究表明，Tan IIA可通过直接靶向FGFR1并影响其下游信号通路，尤其是调控自噬流，从而对MI发挥心肌保护作用。该研究在明确化合物与特定分子靶点之间关系的基础上，支持“机制驱动药物发现”和精准医学研究范式。研究为理解Tan IIA临床作用提供了精确分子基础，并提示在FGFR1信号异常调控人群中，未来或可进一步探索患者分层策略。
更重要的是，该研究将Tan IIA从传统意义上的“多效性天然产物”重新定义为一种FGFR1胞外结构域导向的变构调节剂：它能够促进FGFR1反式自磷酸化，同时限制其催化周转。这一认识超越了经验性用药层面，定义了Tan IIA心肌保护作用的靶点特异性机制，并为面向缺血性心脏病的精准植物药干预策略开发提供了较为坚实的分子框架。
同时，作者也指出本研究仍存在局限。Tan IIA可能还会与FGFR1之外的其他靶点相互作用，未来对其多靶点效应进行更全面探索，将有助于进一步理解其抗MI机制。此外，当前自噬评估方法主要依赖LC3免疫印迹等静态标志物，而准确测量动态自噬流仍是该领域公认挑战。后续研究需要采用串联荧光LC3报告系统或特异性溶酶体抑制剂等方法，以获得更精确的自噬流测量结果，并进一步阐明这一生物过程的动态特征。
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