单颗粒冷冻电镜三维重构技术是目前用于解析生物大分子高分辨率结构的主流手段之一。然而，高质量的冷冻电镜样品制备仍然面临很多挑战，如气液界面、优势取向和背景噪音等，极大地限制了结构解析的效率。

针对这些问题，北京生物结构前沿研究中心王宏伟课题组、清华大学药学院饶燏课题组和北京大学彭海琳课题组合作研发了一种新型功能化石墨烯电镜载网，有助解决样品颗粒优势取向和气液界面等问题。

近日，北京生物结构前沿研究中心王宏伟课题组、清华大学药学院饶燏课题组和北京大学彭海琳课题组合作，在Nature Communications期刊发表了题为：Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM（带有多种电性修饰的石墨烯支撑膜用以单颗粒冷冻电镜结构解析）的研究论文。

该研究合成了多种带有不同电荷性质基团（如氨基和磺酸根）的重氮盐分子，并利用这些重氮盐分子对CVD生长的石墨烯膜进行功能化修饰，进而获得带有不同电荷性质的石墨烯支撑膜。他们利用石蜡作为转移介质，将石墨烯支撑膜洁净转移到电镜载网上，用以冷冻电镜样品制备。

经过冷冻电子断层扫描重构表征，这种功能化石墨烯支撑膜保证了对目标生物大分子的有效吸附，避免了气液界面所带来的潜在风险。另外，因为石墨烯表面修饰的基团带有不同的电荷性质，从而提供了与目标生物大分子不同的相互作用方式，达到丰富取向分布的目的。

单颗粒冷冻电镜数据分析表明，带有负电性修饰的石墨烯倾向性地结合生物大分子颗粒表面的正电性区域，而带有正电性修饰的石墨烯则结合生物大分子颗粒的负电性区域，实现了调控生物大分子的取向分布。乳酸乳球菌第二类内含子LtrB RNP在常规支撑膜上具有严重的优势取向问题，从而较难获得高分辨率重构。在该研究中，这种带有不同电性修饰的功能化石墨烯支撑膜能够调控LtrB RNP的取向分布，成功解决了优势取向问题，最终获得了分辨率达3.2Å的三维重构结果。并且，在三维重构过程中，相比没有修饰的普通石墨烯支撑膜，LtrB RNP在功能化石墨烯膜上的颗粒有效利用率也明显增加。

这些数据表明这种功能化石墨烯支撑膜提供了一个较为友好的作用界面，有助于保护生物大分子的三维结构。

图. 20S蛋白酶体以及核糖体在不同电性修饰的石墨烯（NFG：正电性修饰；SFG：负电性修饰）上的取向分布

清华大学生命科学学院/北京生物结构前沿研究中心王宏伟教授、清华大学生命科学学院博士后刘楠、清华大学药学院饶燏教授以及北京大学化学与分子工程学院彭海琳教授为论文共同通讯作者，清华大学生命科学学院2019级博士生陆叶、博士后刘楠，清华大学药学院2019级博士生刘永波以及北京大学化学与分子工程学院博士毕业生郑黎明为本文共同第一作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-34579-w

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