Introduction
巴氏杀菌乳不仅是乳制品最有营养的来源之一，而且是一种复杂的生物液体，可作为许多微生物的良好生长介质。但由于巴氏杀菌乳加工技术的特点，一些病原微生物被残留下来，从而导致许多不同的微生物在适当的生长条件下进行生长。事实上，巴氏灭菌乳如果在长期或远距离储存和运输过程中不适当储存，极其容易变质，甚至影响产品的质量和安全。因此，营养和食品安全之间的两难选择已成为制约中国巴氏杀菌乳制品生产和消费的紧迫技术问题。
事实上，最近的研究已经开始越来越多地关注生奶中存在的微生物及其与乳制品质量的相关性。据报道，抵达乳制品加工厂的原料奶中同时存在拟杆菌和芽孢杆菌。大多数拟杆菌株都有在低温下生长的能力，而只有少数芽孢杆菌通常在特定条件下生长。在巴氏杀菌乳的早期货架期中，芽孢杆菌是主要的菌群，在长时间的储存间隔中占95%以上。此外，乳制品的微生物群也受到产品包装参数的影响。虽然这种能力仅在某些属/种中观察到，例如拟杆菌属和假单胞菌属，但这些菌株似乎是冷藏条件下牛奶变质的主要原因。由于这些菌株在不同的研究中并不完全一致，在不同的储存条件下，包装巴氏杀菌乳制品中未被识别的微生物可能会对产品质量和安全产生不同的影响。因此，对核心菌株种群及其在储存过程中的动态变化进行详细调查，可能有助于解决乳品业中与食品质量和安全相关的问题。
沈阳农业大学食品学院武俊瑞教授、乌日娜教授、丁瑞雪博士等在本文以包装巴氏杀菌乳产品为研究对象，测定了理化性质、营养成分及微生物学特性，并探讨了它们之间的相关性；针对核心功能微生物群进行了更全面的分析，为探索储存条件安全性的差异和相似性提供了新的见解。
Results and Discussion
巴氏杀菌乳样品在储存过程中的理化和营养特性分析
在不同的储存条件下，测定了巴氏杀菌乳样品的化学成分。牛奶样品中蛋白质、脂肪、SNF、pH、酸度、L*、a*、b*值的结果见表1。在各贮藏条件下，不同处理的乳脂组成没有差异（P>0.05）。牛奶的色度特性没有差异（P>0.05），而乳样品的L*值在0、4和10 ℃时缓慢下降，这可能是由于储存温度的影响，导致产品的颜色和折射率发生变化。此外，酸度和pH值也受到影响，0~15 ℃和25 ℃贮存3天，超过国家标准（GB 5009.239-2016）规定。这种影响可能归因于巴氏杀菌乳的酸度由于微生物引起的变质影响而趋于降低。
表1 不同储存条件下包装的巴氏杀菌乳的化学成分
巴氏杀菌乳样品在储存过程中微生物种群的动态
为了研究不同贮藏条件下的微生物种群动态，对所有牛奶样品进行了16S rRNA基因测序。OTU序列以97%的相似性水平进行分类，发现1 897 个OTU累积在巴氏杀菌乳中。图1显示了储存的巴氏杀菌乳样品PCA的主成分分析，二维模型（PC1和PC2）解释了总方差的77.57%。根据OTU水平的PCA聚类分析，将样本分为5组，分别在0、4、10、15和25 ℃下进行聚类分析。研究发现，在4 ℃下储存3天和6天以及在10 ℃下储存3天的样品被分为一组，其他样品则不分组。结合样品聚类分析，结果表明，贮存温度对巴氏杀菌乳中微生物的丰度有显著影响，值得进一步研究和分析。
在不同贮藏温度和时间下对样品进行分组表明，它们在门水平上共享相同的丰度（即，在门水平上所有样品的总序列超过1%），但它们的相对丰度不同（图2）。结果表明，在细菌群落中鉴定出6个优势门，包括变形菌、厚壁菌、柔嫩菌、拟杆菌、放线菌和糖化菌。变形菌是鉴定门水平中的主要细菌（P<0.01），占细菌总数的50%以上。在4、10和15 ℃时，随着时间的推移，细菌种群的多样性显著降低，变形菌种增加，而柔嫩菌和厚壁菌的种群则逐渐下降。此外，蛋白细菌的丰度几乎与在25 ℃贮藏15天的厚壁菌丰度相同，这可能是由于嗜冷细菌的生长导致的，本研究中样本之间观察到的种群差异具有统计学意义。
在属水平上，高通量测序结果显示巴氏灭菌乳样品中存在44个不同属。有趣的是，在0 ℃保存的样品中，微生物表现出丰富的多样性，并且在15天内基本保持一致。在0 ℃时，四个优势菌群分别为支原体（12.97%）、未分类草酸杆菌科（10.97%）、假单胞菌（9.08%）和不动杆菌（8.71%）。此外，在4、10和15 ℃下储存的巴氏杀菌乳中的微生物随储存温度和时间变化很大。在4 ℃时，假单胞菌和气单胞菌数量显著增加（P<0.05），它们的存在分别占总微生物区系的57.15%和19.95%。假单胞菌据报道是生乳中最有害的嗜冷细菌之一。在冷藏条件下，它很容易成为优势菌群，长期贮存可直接导致种群转化，大量嗜冷细菌的存在被认为是巴氏杀菌乳变质的最常见原因。本研究发现，气单胞菌在4、10和15 ℃贮藏6天后数量显著增加。事实上，气单胞菌在环境中广泛存在，其中就包括生牛奶，它与变质密切相关。此外，在乳制品加工厂、储存在4 ℃的原料奶样品和散装奶储罐中也发现了沙雷氏菌属。在本研究中，在4 ℃保存的巴氏杀菌乳样品中检测到了沙雷菌，并在25 ℃贮藏时发生了显著的变化。贮藏6天后，优势气单胞菌数量显著减少，沙雷菌数量急剧增加，成为优势菌，持续到第15天。此外，在巴氏杀菌乳样品储存9天的过程中，发现了两种厌氧芽孢杆菌（敏感梭状芽孢杆菌stricto-12和敏感梭状芽孢杆菌stricto-13）和瘤胃杆菌。已知这两种细菌会引起人类和动物的炎症、败血症和其他疾病。
图1 不同储存条件和操作分类单元(OTU)水平的微生物计数的主成分分析
图2 储存的巴氏杀菌乳样品中微生物群落的残留物。(a)门和(b)属水平上的相对丰度
与贮存中巴氏杀菌乳样品营养成分相关的核心功能微生物群
使用RDA和相关 热图 分析了牛奶中核心营养化合物在不同储存条件下对微生物群落组成的影响（图3和图4）。 结果表明，样品中的细菌群落明显受营养物质、氨基酸和味觉值的影响。 一些细菌与苯丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸的丰度、酸度和b*值呈正相关，如假单胞菌、气单 胞菌、沙雷菌和拟杆菌。 根据以往牛奶的基本指标和不同贮藏条件下的理化指标（表1），确定了不同贮藏条件下牛奶对相关微生物的影响。 牛奶中检测到的主要细菌在第7天为假单胞菌和德尔夫提亚菌，这可能是由于乳制品的长期储存导致脂肪酸败、凝胶化和苦味。 假单胞菌的脂解能力取决于这些微生物分泌的脂肪酶，这些脂肪酶主要作用于甘油三酯的α部分，产生苦味和难闻的香气。 本文还分析了味觉和菌落结构之间的相关性，并确定了4种细菌为核心微生物，它们与蛋白质和脂肪、苦味和甜味水平呈负相关，参与了研究的微生物功能特征，促进糖代谢、蛋白水解和重要代谢物的产生。 此外，在25℃时，梭状芽孢杆菌（Clostridium-sensu-stricto-12）、梭状芽孢杆菌（Clostridium-sensu-stricto-13）和鲁梅利杆菌（Rummeliibacillu）的丰度显著增加，成为新的优势菌属，并与5种氨基酸（Met、Leu、Ile、Val和His）的含量呈正相关。 因此，对巴氏杀菌乳的微生物生长动态和理化营养成分的分析表明，乳制品在长期贮存期间会发生合理的变质。
图3 冗余分析(RDA)分析了储存的巴氏杀菌乳样品的细菌群落变化的物理化学和营养特性特征
图4 与营养成分相关的核心细菌群落的热图分析
Conclusion
本文研究了巴氏杀菌乳的理化参数、营养成分（16 种FAA、7 种口味值和8 种化学成分）和微生物特征，并探讨了它们之间的相关性。结果表明，巴氏杀菌乳的储存温度和时间对牛奶样品的理化参数、营养成分和微生物群分布有显著影响。假单胞菌、气单胞菌、拟杆菌和沙雷菌在内的微生物在细菌属的丰度上表现出最显著的变化，与蛋白质含量和味觉值呈负相关，促进了糖代谢、蛋白质水解和重要代谢物的产生。根据研究发现，在4 ℃下储存0~9天的巴氏杀菌乳的质量较好，微生物丰度较低。在10 ℃保存3天和6天后，微生物的丰度与4℃相似，也保持了巴氏杀菌乳的良好的品质。因此，这些发现除了增强对乳制品行业中乳制品质量控制参数的了解外，还为包装巴氏杀菌乳的安全性提供了新的见解。
第一作者简介
丁瑞雪，女，2019级沈阳农业大学食品学院博士研究生，主要从事乳制品微生物及耐药性等方面的研究。曾获2021年研究生创新培育项目立项资助并主持该项目，参与2项国家自然科学基金项目及计算机软件著作权1项；获得2021学年度研究生国家奖学金、校长奖学金、学业奖学金等多项荣誉。现以第一作者身份发表高水平论文8篇，其中SCI收录论文4篇，ESI高被引论文1篇，EI收录论文2篇，中文核心论文2篇。
通信作者简介
武俊瑞，博士，教授，博士生导师，荷兰瓦赫宁根大学访问学者，辽宁省食品发酵技术工程研究中心常务副主任，沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室主任，方向带头人，辽宁省百千万人才工程千人、辽宁省创新人才、辽宁省杰出青年学者成长计划、沈阳市中青年科技创新领军人才、沈阳市高层次拔尖人才、辽宁省科技特派员、天柱山英才等。现任主要研究方向为益生菌、乳制品和发酵食品方面的研究。兼任International Society of RNA Nanotechnology and Nano medicine (ISRNN)、American Dairy Science Association会员、中科院沈阳转移中心科技顾问、大连理工大学特聘研究员、国家食药同源联盟理事兼发酵专委会委员、中国肠微生态-疾病整合联盟科技顾问、中国微生物学会酿造分会专委会委员、全国无抗产业科技创新联盟常务理事，中国食品科学技术学会、中国农学会农产品贮藏加工分会、中国功能性食品产业联盟、中国微米纳米学会理事，国家林业与草原局教材评审委员会专家等，伊利、蒙牛、雨润、榆园食品等企业咨询专家，《中国微生态学杂志》、《乳业科学与技术》等杂志编委。主持国家自然科学基金面上项目3项，主持其他项目30余项；参加国家863、十二五、十三五、国家星火计划重大项目、国家综改办项目等课题40余项。发表论文 150余篇，其中，SCI收录论文63篇，EI收录论文28篇。3篇ESI高被引论文，1篇入选2015—2019年“领跑者5000——中国精品科技期刊顶尖学术论文”。申请国家专利51件，已授权21件，获得授权的软件著作权11件。主编、副主编教材和著作16部。研究成果获中国食品工业科学技术特等奖、农业部神农中华农业科技奖、全国商业科技进步二等奖、辽宁省自然科学奖、辽宁省科技进步二等奖、山东省科技进步二等奖、齐鲁农业科技二等奖等多项奖励。
乌日娜，教授，博士生导师，博士后合作导师，辽宁省食品发酵技术工程研究中心主任，全国百篇优秀博士论文提名论文获得者，江南大学食品科学与技术国家重点实验室、国家功能食品工程技术研究中心博士后，食品安全与营养协同创新中心“乳制品创新平台”岗位专家，入选辽宁省百千万人才工程百人、辽宁省首批“兴辽英才”、辽宁省农业领域青年科技创新人才、辽宁省高等学校优秀人才、沈阳市高层次领军人才、沈阳市中青年科技创新人才、天柱山学者等。兼任国家食药同源科技创新联盟常务理事兼发酵专委会副会长、中国食品科学技术学会传统酿造食品分会常务理事、中国食品科学技术学会特殊食品分会常务理事，中国农学会农产品贮藏加工分会、中国食品科学技术学会、中国畜牧兽医学会微生态分会理事，《Frontiers in Microbiology》客座主编，《中国微生态学杂志》、《食品研究与开发》、《中国酿造》、《乳业科学与技术》等杂志编委。主持国家自然科学基金项目课题4项，区域联合基金项目课题1项，其他项目20余项，参加国家863重大项目、国家“十二五”科技支撑、国家星火计划重大项目、国家自然科学基金等课题30余项。研究成果荣获全国百篇优秀博士论文提名论文获、全国食品工业科技进步特等奖、全国商业联合会科技进步二等奖、全国食品科技创新二等奖、辽宁省科技进步二等奖等多项奖励。申请国家专利62件，已授权27件。发表科研论文200余篇，其中SCI收录86篇，EI收录25篇。编著专著和教材16部，其中，英文专著2部。
Characterization of the core microflora and nutrient composition in packaged pasteurized milk products during storage
Ruixue Dinga, Shanshan Yanga, Lijuan Gengb, Yumeng Liua, Baoping Hec, Liyun Liud, Rina Wua,*, Junrui Wua,*
a College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China.
b Shenyang Institute for Food and Drug Control, Shenyang 110122, China.
c Inner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd., Hohhot 010080, China.
d China Mengniu Dairy Co., Ltd., Hohhot 010000, China
*Corresponding authors.
Abstract
Pasteurized milk contains complex microbial communities affected by sterilization and storage conditions. This complex microflora may be the possible reason that pasteurized dairy products are highly prone to spoilage. In this study, packaged pasteurized milk products collected from dairy processing factories in China were stored at 0, 4, 10, 15, and 25 ºC for 0−15 days and subjected to microbial identification using high-throughput sequencing. Accordingly, 6 phyla and 44 genera were identified as the dominant microbiota. Moreover, the changes in nutritional composition of the pasteurized milk, including in 16 free amino acids, 7 taste values, and 8 chemical constituents, were analyzed using principal component and multi-factor analyses. The Pearson correlation analysis identified Pseudomonas, Aeromonas, Paenibacillus, and Serratia genera as the core functional microbiota that significantly affects the nutritional composition of pasteurized milk. Hence, the results provide a comprehensive understanding of the safety and shelf-life of stored pasteurized milk.
Reference:
DING R X, YANG S S, GENG L J, et al. Characterization of the core microflora and nutrient composition in packaged pasteurized milk products during storage[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1279-1286. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.010.
文章编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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