以苯扎氯铵为代表的季铵盐类杀菌剂具有杀菌效果显著、综合成本低廉的特点，季铵盐类杀菌剂通过破坏细菌的细胞壁，造成细菌细胞内低分子质量物质的泄漏，蛋白质和核酸的降解。菌株经历苯扎氯铵适应后会导致其对同种杀菌剂的耐受性增强，对食品安全造成威胁。因此研究经历苯扎氯铵适应后食源性致病菌的抗性变化机制，阐明这些机制对于监测和限制食源性致病菌的传播至关重要。
上海理工大学健康科学与工程学院牛洪梅、朱华剑、王翔*等人分别围绕食源性致病菌的苯扎氯铵适应对苯扎氯铵的直接耐受性和抗生素的交叉耐受性的影响进行总结，同时从不同方面深入探讨菌株抗性变化机制，最后对未来的研究方向提出展望，旨在为真实环境中食源性致病菌的控制提供理论支持，为苯扎氯铵等杀菌剂的合理使用提供参考，以期更好地保障食品安全。
1.苯扎氯铵适应与食源性致病菌直接耐受性的关系
消毒剂的过度稀释、消毒后未充分清洗造成的化学物质残留及苯扎氯铵较差的生物降解性等各种因素均可导致微生物暴露于不同浓度梯度的苯扎氯铵中，细菌较长时间处于苯扎氯铵作用下可产生杀菌剂适应性，进而诱导直接抗性的产生。了解产生苯扎氯铵适应性的可能因素，探究直接抗性产生的机制可为食源性致病菌的有效控制提供理论支持。
1.1 苯扎氯铵适应对食源性致病菌直接耐受性的影响
环境中各种因素可以促使食源性致病菌对苯扎氯铵产生适应性：首先，由脂肪、碳水化合物、核酸和蛋白质等组成的生物被膜限制了杀菌剂的有效性，生物被膜的存在是菌株杀菌剂耐受性改变的重要原因。其次，水污染、冲洗不当和食品基质的保护作用均可以使苯扎氯铵的有效浓度降低至亚致死水平。最后，由于季铵盐类杀菌剂具备较差的生物降解性，因此细菌存在与其长期接触的可能性，增加微生物暴露于亚抑制浓度杀菌剂中的风险。暴露于亚抑制浓度的杀菌剂后，多数食源性致病菌对苯扎氯铵表现出增强的耐受性，即苯扎氯铵适应诱导食源性致病菌产生了直接耐受性。
目前，没有统一的标准判定食源性致病菌是否对某杀菌剂具备耐受性，研究者往往通过MIC、最小杀菌浓度（MBC）和最小生物被膜根除浓度（MBEC）的变化判定菌株是否产生了直接抗性。一般情况下菌株的MIC增加，表明菌株对杀菌剂的直接耐受性增强或者敏感性降低。暴露于苯扎氯铵而导致的直接抗性可能为暂时的或稳定的，苯扎氯铵适应诱导的直接抗性稳定性因致病菌的种类而异。
苯扎氯铵存在对致病菌的直接抗性产生起到关键作用。目前，欧洲市场将食品中苯扎氯铵的残留量由原来的0.5 mg/kg修改为0.1 mg/kg。美国FDA最新公布的手部杀菌剂产品中所用化学品的建议未涉及苯扎氯铵的限量建议。我国GB 26369—2020《季铵盐类消毒剂卫生要求》未对季铵盐类消毒剂的具体用量和残留量进行规定。
最佳的消毒方案不仅可以降低消毒成本、减少消毒剂对环境的影响，同时在确保食品安全的基础上降低直接抗性的产生。因此，研究食源性致病菌对加工环境中经历苯扎氯铵适应后生长、失活和毒性等生物学特性的变化将有助于工厂制定有效的杀菌消毒策略。为避免微生物直接耐受性的产生，应开发具有不同作用模式的杀菌剂。
1.2 苯扎氯铵适应影响致病菌直接耐受性增强的机制
暴露于杀菌剂而导致微生物杀菌剂耐受性发生改变可以是暂时的（表型适应）或稳定的（遗传基因变化）。细菌具备苯扎氯铵抗性的机制可分为先天性、适应性或获得性3种。适应性抗性为细菌细胞暴露于给定环境胁迫而产生的基因型和表型改变。当细菌面临苯扎氯铵适应条件时，多种遗传和生理机制会发生改变进而产生直接抗性。
1） 外排泵相关基因的表达
外排泵家族基因的存在或上调与多种细菌苯扎氯铵敏感性降低有关，其通过增加杀菌剂的外排量降低细胞内杀菌剂的浓度，使细菌在较高浓度的化学物质环境下存活。细菌产生杀菌剂抗性的重要机制之一是外排泵作用，外排泵由5个蛋白家族组成，包括ATP结合盒（ABC）超家族、多药及毒性化合物外排（MATE）家族、耐药节结化细胞分化（RND）家族、小多重耐药性（SMR）家族和主要协同转运蛋白超家族（MFS）。除ABC家族直接利用ATP能量作为驱动力外，其他4个家族均靠跨膜H＋或Na＋提供动力。
革兰氏阳性细菌中最常见的季铵盐抗性基因属于MFS的qacA/B基因系统，目前单增李斯特菌外排泵的研究相对较为成熟，QacA主要利用质子动力对抗细胞内的季铵盐类杀菌剂。MdrL和Lde等属于MFS，与单增李斯特菌的苯扎氯铵适应和对苯扎氯铵的抗性有关。ABC转运体是最大的超家族，bcrABC、emrE和qacH等特定外排泵基因在单增李斯特菌对季铵盐类杀菌剂抗性的获得中具有重要作用。在金黄色葡萄球菌中，染色体编码的杀菌剂外排泵包括MepA蛋白（属于MATE家族）和NorA、NorB、MdeA、LmrS蛋白（属于MFS家族），而质粒编码的杀菌剂外排泵包括QacA、QacB蛋白（属于MFS家族）和Smr、QacG、QacH、QacJ蛋白（属于SMR家族）。染色体编码和质粒编码的外排泵均可赋予金黄色葡萄球菌对季铵盐类杀菌剂的耐受性。苯扎氯铵的适应性与菌株外排泵基因或者生理上的调整相关，适应性可诱导细菌对同源杀菌剂耐受性的变化。转录组测序是分析菌株差异基因表达的常用工具，可以使用该方法识别外排泵基因与调控通路在苯扎氯铵抗性表型变化中的作用。表型抗性检测与分子生物学特征分析的结合可以为苯扎氯铵适应菌株的风险评估提供数据支持。
2） 细胞膜修饰
细胞膜中膜蛋白、脂肪酸和磷脂的组成及含量的变化赋予了细菌对杀菌剂的耐受性。部分苯扎氯铵耐受细菌细胞呈现出细胞表面负电荷减少、疏水性增强和粗糙度降低的特点。细胞内饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量改变导致细胞流动性降低，细胞膜表面修饰有助于菌株增加对苯扎氯铵的抗性。鲍曼不动杆菌和大肠杆菌孔隙的减少降低了细胞膜通透性，导致二者对杀菌剂的耐受性增加。此外，膜磷脂的变化会限制季铵盐类杀菌剂的吸附和渗透，从而导致杀菌功效的逐渐丧失。由于磷脂的增加，苯扎氯铵渗入铜绿假单胞菌的能力降低，菌株杀菌剂耐受性增强。当苯扎氯铵作用于食源性致病菌时，细胞中有利的染色体突变可以诱导细胞修饰，修饰主要体现在细胞外膜组成和结构的改变，其可以阻止抗菌药物的渗透。革兰氏阳性细菌中的细胞壁和革兰氏阴性细菌中的外膜可充当屏障有效抵御苯扎氯铵进入细胞内部。膜脂肪酸分布、流动性和完整性等生理功能变化是直接抗性产生的潜在机制。
3） 活的非可培养状态表型的形成
活的非可培养状态（VBNC）可以由饥饿、酸碱、氧化应激和抗生素应激等环境条件诱导获得。该状态下的细菌虽不能在传统实验室培养基上生长，但可以存活并可以保持细胞的完整性、毒性和代谢活性。与可培养状态细胞相比，VBNC细胞具备更强的物理、化学和抗生素耐受性，细菌处于该状态时代谢活性较低，同时细胞壁稳定性因肽聚糖交联的增加而增强。微生物可能存在多种机制应对不利或应激条件，应激下的微生物可以表现出代谢和细胞结构变化。除苯扎氯铵适应外，酸、冷、热和营养缺乏等环境条件均有可能诱导VBNC的产生，使微生物存在于更恶劣环境中，将来有必要对此作进一步研究。
4） 其他抗性机制
生物被膜可以通过降低杀菌剂的扩散水平、与杀菌剂中化合物的相互作用或增加突变等提高对杀菌剂的耐受性。在生物被膜内部，营养物质的竞争和有限的氧气消耗可以导致细胞生长缓慢和饥饿，饥饿应激有助于苯扎氯铵直接耐受性的产生。相对于浮游态细胞，肠炎沙门氏菌生物被膜中的细胞更容易对苯扎氯铵形成适应性。突变或差异基因表达等可导致细菌产生对苯扎氯铵的直接耐受性。同时，杀菌剂耐受性基因的可移动遗传元件如质粒和整合性结合元件可以从供体细胞转移到受体细胞。全基因组测序技术等生物信息学技术的进步或许能解释食源性致病菌抗性变化的原因，未来可通过新技术手段明确各致病菌苯扎氯铵适应诱导的直接抗性变化机制。
综上，苯扎氯铵适应产生的杀菌剂耐受性机制主要表现为细胞膜结构和组成的修饰、外排泵相关基因的表达以及VBNC、生物被膜等状态菌的形成。上述研究表明食源性致病菌在苯扎氯铵适应条件下可激活多种遗传机制，使其在同种杀菌剂环境中保持活力和致病性。
2 苯扎氯铵适应与食源性致病菌抗生素耐药性的关系
暴露于苯扎氯铵中的细菌不仅会产生直接抗性，还可以对抗生素等其他杀菌剂产生交叉抗性，其中由苯扎氯铵使用引发的耐药性增强的风险引发了广泛关注。细菌对苯扎氯铵产生适应性是由多种机制共同作用产生的，探究杀菌剂适应后抗生素耐受的变化及其机制的形成具有重要意义。
2.1 苯扎氯铵适应对食源性致病菌抗生素耐药性的影响
近几十年来，以苯扎氯铵为代表的亚抑制浓度使用成为抗生素耐药性增加的原因之一。菌株经杀菌剂适应后的耐药性增强分为可遗传和不可遗传两种情况，耐药表型变化可通过MIC值变化呈现。Capita等研究发现，经苯扎氯铵适应的阪崎克罗诺杆菌对环丙沙星的耐药性增强，多数研究证明食源性致病菌在经历苯扎氯铵适应后均可获得耐药性 （表1） 。综上，苯扎氯铵适应和菌株耐药性变化间可能存在联系，这也是目前FDA禁止将三氯生用于抗菌肥皂中的原因之一。苯扎氯铵适应后菌株的抗生素耐药性增强现象不容忽视，应对其进一步研究。
多数研究发现季铵盐类杀菌剂适应后菌株的抗生素敏感性显著降低，然而部分研究也发现抗生素敏感性增强。目前苯扎氯铵适应导致菌株抗生素耐药性增强的研究中并没有证明耐药性增强出现的方向性，即由于暴露于苯扎氯铵杀菌剂后有可能发生增强的抗生素耐药性，但目前不能证明杀菌剂的适应和某种抗生素耐药性的增强之间一定存在因果关系。总体而言，目前的证据表明，消毒剂适应是实验室条件下诱导菌株抗生素耐药性增强的因素之一，而非决定性因素。
2.2 苯扎氯铵适应影响食源性致病菌抗生素耐药性增强的机制
1） 生物被膜的形成
生物被膜的形成可导致菌株对抗生素的敏感性降低，作用机制包括细胞外聚合物包裹细菌细胞的屏蔽作用、生物被膜内细胞的低代谢活性及生物膜细胞中的外排泵等将杀菌剂排出细胞。当细菌形成生物被膜时，生物被膜的相对低渗透性降低了细菌细胞对抗生素的敏感性，菌株耐药性增强。众多研究表明，与浮游细菌的耐药性相比，黏附状态的生物被膜细胞对抗生素等杀菌剂具有更强的耐受性。此外，抗生素耐药基因常通过基因水平转移在生物被膜内细菌之间转移，从而允许耐药性在细菌群体内传播。因此，生物被膜中受苯扎氯铵胁迫的细胞可能通过产生适应性和交叉抗性而导致耐药菌的出现和扩散。
2） 自发性突变和基因的水平转移
突变作为微生物的一种逃逸策略可以使菌株产生抗生素耐药性，比如季铵盐类杀菌剂可以触发细菌喹诺酮耐药决定区位点突变。与此同时，同种细菌菌株之间甚至不同种细菌菌株之间可移动遗传元件（例如转座子或质粒）的水平转移可促进抗性基因的快速传播并推动细菌的进化。细菌通过突变和基因水平转移以增加其对不利条件的抗性，这些遗传物质发生变化的群体可在更恶劣条件下存活。因此，未来对毒性和抗生素耐药性关系的探索也可为食源性致病菌的控制提供理论基础。
3） 外排泵的作用
存在于细胞膜外层的外排泵可介导细胞与其外界环境间的分子交换。外排泵不仅可以将苯扎氯铵从细胞内排出，而且还可以将抗生素排出以应对外界胁迫。MFS外排泵（SmfY）、SMR外排泵（SsmE）和ABC外排泵（SmdAB）的表达提高了革兰氏阴性菌对抗生素的耐药性。可以明确外排泵是细菌耐药性的重要因素，外排泵可主动将细菌细胞抗生素排出，以避免抗生素对微生物产生破坏作用。表2总结了细菌中外排泵的存在对常见抗生素的外排作用。
研究发现外排泵抑制剂苯基精氨酸-b-萘酰胺降低了CIP和季铵盐类杀菌剂的MIC，表明大肠杆菌中CIP和季铵盐类杀菌剂耐受性均依赖于外排泵系统。外排泵抑制剂在抗生素耐药性研究中具有重要作用，抑制剂研究为防止临床中抗生素耐药性增强提供理论基础，探究外排泵基因发挥作用的方式和详细通路可以对耐药的产生状况作出相应预警。通常情况下杀菌剂的外排是由几个外排泵协调介导的反应。食源性致病菌外排系统具有错综复杂的监管系统，某一外排泵在耐药性表型上所发挥的作用难以直接判定，外排泵系统及其监管系统在耐药型的表征有待进一步研究。
4） 其他机制
食源性致病菌杀菌剂耐受性和抗生素耐药性的产生可能存在直接联系，两者具有相似的抗性产生机制，如外排泵的合成和细胞膜流动性的变化。细胞膜流动性在维持细胞各种生理活动如营养运输和细胞形态等中发挥重要作用，多数微生物可通过细胞膜状态的转变适应环境应力，该适应策略最终可导致卫生控制措施失效。面对苯扎氯铵胁迫时，革兰氏阴性细菌主要通过调节不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例并在较小程度上调节环丙烷脂肪酸或不饱和脂肪酸的顺反异构化水平来改变膜流动性。此外，σ因子是细菌中应激反应基因表达的关键因素，目前有研究发现万古霉素和乳酸链球菌素等抗菌物质可以诱导其表达。同时，细菌信号传导系统的双组分系统能够迅速感知和响应外界环境的变化，双组分系统可以在抗生素、渗透压和氧化应激等各种刺激中发挥关键作用。各种机制的存在为食源性致病菌的苯扎氯铵适应性提供了保障，提供微生物苯扎氯铵适应的机制也会为抗生素等其他杀菌剂耐受性提供交叉保护作用进而影响食品安全。食源性致病菌经历苯扎氯铵适应后，表现出的适应机制整合如图1所示。产生交叉抗性的原因大致分为以下几类：杀菌剂和抗菌类化合物作用于同一细胞靶点；杀菌剂和抗菌化合物的转运机制相同，如生物被膜的形成；杀菌剂和抗生素耐受性受控于相同的抗性基因；对杀菌剂耐受性和抗生素耐药性有贡献的基因位于同一移动遗传元件上并于新的微生物宿主系统中表达。因此，若暴露于苯扎氯铵的菌株在环境中存活，其可能对同种杀菌剂产生直接抗性或者对抗生素产生交叉耐药性。
结语
蛋白质等有机物的残留和生物被膜的存在或者其他因素可使食源性致病菌反复暴露于苯扎氯铵中，从而增强致病菌对杀菌剂的耐受性，对食品安全造成潜在威胁。细菌适应苯扎氯铵的过程由多种机制共同作用，探究苯扎氯铵适应诱导的直接抗性与交叉抗性及相应机制有助于评估实际生产加工环境中的食源性致病菌构成的风险。杀菌剂的使用与菌株抗性表型变化表明杀菌剂的正确合理使用是保证食品安全的重要因素，食品生产环境中应严格遵守杀菌剂制造商的使用说明。依据现有杀菌剂适应对食源性致病菌抗性影响研究中存在的问题，对今后的研究提出以下建议：1）苯扎氯铵抗性和抗生素耐药性还可以通过环境应激如高/低温、pH值和渗透胁迫等应激改变，因此食品加工环境中其他应激源对食源性致病菌耐受杀菌剂的影响也值得进一步探究；2）实际生产加工中，苯扎氯铵适应是否赋予食源性致病菌对热、冷、酸、干燥等食品加工环境胁迫产生交叉抗性也是一个值得思考的重要问题；3）尽管理论上苯扎氯铵的使用与食源性致病菌耐药性的产生存在因果关系的风险，但多数研究均为基于实验室生长细菌进行体外研究，且目前缺乏强有力的因果证据证明苯扎氯铵暴露与多重耐药性菌株的出现或传播相关。因此，在现有理论证据的基础上和“预防原则”下，应进行与真实食品生产环境条件的相关研究，以了解和量化苯扎氯铵等杀菌剂诱导抗生素耐药性的可能性与方向性；4）建议新型杀菌剂的授权应明确杀菌剂是否具备驱动微生物直接和交叉抗性形成的潜力。
本文《苯扎氯铵适应对食源性致病菌杀菌剂 耐受性影响的研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷第11期329-337页，作者：牛洪梅，朱华剑，许莉 ，王园，刘阳泰 ，秦晓杰，董庆利 ，王翔。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220728-309。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南农业大学食品科技学院 李曦明；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家肉类加工工程技术研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，贵州大学、贵阳学院共同主办，贵州医科大学、清华大学深圳国际研究生院、河南省大鲵保护与发展协会支持协办，中国食品杂志社《肉类研究》杂志、《乳业科学与技术》杂志、《Food Science of Animal Products》承办，钛和中谱检测技术（厦门）有限公司、贵州油研纯香生态粮油科技有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、四川安好众泰科技有限公司、贵州成义烧坊酒业股份有限公司、贵州黔醉酒业（集团）有限公司、黔东南民生食品有限公司、贵州普安红茶业（集团）有限公司等企业赞助的“2023年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”即将于2023年10月28-29日在贵州贵阳召开。
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