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导读
本研究探讨了产前暴露于表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对成年后代小鼠肝脏的影响。虽然EGCG以其健康益处而闻名，但其产前暴露对肝脏的影响仍不清楚。我们将妊娠C57BL/6J小鼠暴露于1 mg/kg EGCG中16天，以评估成年后代的肝毒性作用，我们通过转录组学和代谢组学阐明肝毒性机制。研究结果表明，产前EGCG暴露导致成年小鼠的肝体细胞指数降低，炎症反应增强，并通过增加糖原积累而破坏肝功能。我们综合组学分析揭示了肝脏糖脂代谢的关键通路的显著改变，如糖异生、胰岛素信号失调和肝脏炎症的诱导。此外，该研究发现Ppara的启动子甲基化水平与其mRNA水平之间存在负相关，这表明EGCG可以通过表观遗传修饰降低肝脏脂质含量。研究结果表明，产前EGCG暴露可能对成年人的肝脏产生不利影响，并强调有必要对怀孕期间摄入EGCG相关的潜在风险进行全面评估。
论文ID
原名：Prenatal EGCG consumption impacts hepatic glycogen synthesis and lipid metabolism in adult mice
期刊：International Journal of Biological Macromolecules
IF：8.2
发表时间：2024.01
通讯作者：王勤，李奇渊
通讯作者单位：厦门大学生命科学学院,厦门大学医学院
实验设计
实验结果
1. 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏生理指标的影响
如图1所示，仅在成年雄性小鼠中，产前暴露于饮用水中的EGCG导致肝脏体细胞指数显著下降(12.0%)(图1A)。与对照组相比，EGCG暴露组成年雄性组血清的ALT和AST水平分别显著上调1.15倍和1.35倍，雌性组小鼠血清中ALT和AST水平分别上调1.20倍和1.39倍（图1B、C）。
图1 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏生理指标的影响。（A）肝脏体细胞指数。雄性（对照组，n=10;EGCG，n=9），雌性（对照组，n=9;EGCG，n=7）。（B，C）血清ALT和AST水平（n=7，每次处理4只母鼠，每只母鼠1-2只后代）。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验显著性。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001。
2. 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏代谢物的影响
为了研究产前暴露EGCG是否影响肝脏代谢物，我们采用UPLC/Q-TOF-MS/MS对EGCG组和对照组成年小鼠肝脏代谢物进行了非靶向代谢物检测。根据PLS-DA评分图，成年雄性小鼠（图2A）和雌性小鼠（图2D）对照组和暴露组之间的肝脏代谢物谱明显不同。根据VIP评分>1的标准进行分析，牛磺酸在EGCG成年雄性小鼠中贡献最大，柠檬酸盐、谷氨酸、葡萄糖、3-磷酸甘油、谷胱甘肽二硫化物、尿苷一磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和乳糖的代谢产物具有特异性（图2B）。在雌性小鼠肝脏中，与对照组相比，EGCG暴露组的葡萄糖水平显著升高，次黄嘌呤、肌苷、琥珀酸、腺苷酸、牛磺酸、谷氨酸、乳酸、尿酸、ADP-核糖、谷胱甘肽二硫化物和乳糖的代谢产物也有显著差异(图2E)。我们使用 MetaboAnalyst 5.0软件生成差异代谢物（DEMs）的热图，直观地识别成年雄性（图2 C）和雌性（图2 F）中对照组和EGCG暴露组之间代谢物水平变化的趋势。代谢组学结果显示，成年雄性EGCG暴露组与对照组存在62种DEMs，尤其是糖代谢的代谢物（即葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和果糖的积累）。我们在成年雌性中鉴定出的41种DEMs中，有15种代谢物（腺嘌呤、硫酸吲哚、尿酸盐、蛋氨酸亚砜、羟苯乳酸、5-甲基胞嘧啶、乙醛酸、N-乙酰柳氨酸、甘油磷酸胆碱、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、壬二酸盐、乙酰赖氨酸、葡萄糖-6-磷酸）显著增加，而26种代谢物（10-羟基癸酸盐、1-氨基环丙烷羧酸盐、水杨酸盐、a-KG、3-羟甲基戊二酸盐、氧化谷胱甘肽二硫化物、葡萄糖酸盐、2-HG、胸苷、衣康酸盐、肉碱、甘氨酸、鸟嘌呤、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖胺、鸟苷、左旋多巴、次牛磺酸、甲戊酸盐、嘌呤、戊二酰肉碱、脱氧尿嘧啶、葫芦巴碱、邻苯二甲酸盐、N，N-二甲基精氨酸、谷氨酸盐、次牛磺酸）显著降低。
图2 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏代谢物的影响。基于成年雄性（A）和雌性（D）肝脏代谢物的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。成年雄性（B）和雌性（E）的PLS-DA VIP评分图。成年雄性（C）和雌性（F）的差异表达代谢物（DEMs）热图。表达用Z评分表示（组间相对上调：红色，下调：蓝色）。
3. 产前EGCG暴露对成年子代小鼠肝纤维化和炎症的影响
我们观察到EGCG暴露小鼠肝脏中炎症细胞(图S1)和中性粒细胞(雄性2.71倍，雌性3.43倍)(图3A)的增加，以及胶原纤维(雄性3.04倍，雌性2.26倍)的沉积(图3B)，表明产前暴露于EGCG可能诱导后代小鼠肝脏炎症和纤维化。在EGCG暴露的雄性小鼠的肝脏中，纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-Sma）和胶原蛋白III（9.42和1.78倍）的表达增加支持了这一结论（图3C）。此外，我们在暴露于EGCG的雄性小鼠的肝组织中检测到IL-6（一种促炎细胞因子）水平升高（2.18倍）。转录组学分析进一步显示，与NAFLD相关的基因在EGCG暴露组中上调（图3E至H），这些基因包括Cox6a1、Cyp2el、Cox8a和Cox4il，它们参与各种代谢过程，可能有助于NAFLD的发展。这些发现表明，产前暴露于EGCG可能对肝脏健康产生不利影响，促进炎症、纤维化，并可能导致NAFLD的发展。
图3 产前暴露于EGCG增加了成年后代小鼠的肝脏炎症和纤维化。（A）对照组和EGCG暴露组的MPO染色肝脏切片的代表性图像和MPO染色定量数据。（B）对照组和EGCG暴露组的Masson染色肝脏切片的代表性图像和定量Masson染色数据。比例尺：50 μm。（C）雄性和雌性小鼠肝α-SMA和III型胶原的蛋白质印迹分析。n=每组4只小鼠。（D）对照组和EGCG暴露组小鼠肝脏IL-6水平。n=每组6只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(E, F)RNA-seq数据的基因集富集分析。n=每组3只小鼠。NES，归一化富集得分。(G, H)与对照组相比，EGCG暴露组非酒精性脂肪性肝病前15个上调基因的热图。
4. 产前EGCG暴露对成年子代小鼠肝糖原代谢的影响
在暴露于EGCG的雄性和雌性小鼠中观察到的肝糖原含量显著增加（3.04和1.61倍）（图4A），表明产前EGCG暴露促进了肝脏中糖原的积累。参与糖原生物合成过程的基因如Ppp1r3b、Khk、Gck和Adra1b的上调支持了这一观点，这些基因在糖原合成过程中发挥作用。在糖原分解代谢过程中，暴露于EGCG的雄性小鼠中Akt2、Rb1cc1、Agl和Pygl的表达水平下调，而在雌性小鼠中，Rb1cc1、Agl和Pygl的表达水平上调（图4B和C）。这些基因与糖原分解有关。此外，暴露于EGCG的雄性和雌性小鼠的G6P蛋白水平显著增加（2.73倍和1.26倍），表明糖原代谢增强。此外，PCK2的蛋白表达仅在暴露于EGCG的雄性小鼠中显著增加（3.25倍）（图4D）。综上所述，这些结果表明，产前暴露于EGCG会影响后代小鼠肝脏中的糖原代谢，通过改变糖原合成和分解过程导致糖原积累增加。
图4 产前EGCG暴露增加了成年后代的肝糖原积累。（A）雄性和雌性小鼠的肝糖原含量。n=每组6只小鼠。（B、C）来自转录组学分析的糖原代谢靶基因的热图。（D）G6P和PCK2蛋白的蛋白质印迹分析。n=每组4只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p< 0.05，**p<0.01，***p<0.001。
5. 产前EGCG暴露对成年子代小鼠肝脂质代谢的影响
油红O染色显示EGCG暴露的雄性和雌性小鼠肝脏中的脂滴分别减少了27%和21%（图5A）。此外，暴露于EGCG的雌性肝脏中的TG水平显著降低了30%（图5B）。RNA测序分析（RNA-seq）通过鉴定参与脂质代谢各个方面的基因的下调表达水平，进一步支持了这些发现。在雄性中，与肝脂质合成相关的Acacb、Slc27a1、Fabp5和Fabp4等基因的表达水平降低。此外，参与脂质氧化的基因，包括Ppara、Acad11、Cpt1a和Acox1，表达也下调。与肝脏脂质储存和转运相关的基因，如Apob、Pnpla2、Rxrb、Lpl、Cyp4a10、Plin2和Ehhadh、Acaa1b、Ddhd2、Acsl4、Cd36和Cyp7a1，在雄性中表达水平显著降低（图5C）。在雌性中，与脂质合成相关的Lpin1和Fads2的基础表达水平高于对照组。然而，与脂质储存和运输相关的基因被下调（图5D）。基因表达分析证实了转录组学分析结果，显示出与脂质代谢相关的特定基因的相对表达水平的一致趋势，包括脂质合成（Acacb，Lpin1）、脂质氧化（Ppara，Mlycd）、脂质储存（Acad11，Apob）和脂质转运（Pnpla2，Ddhd2）（图5E和F）。总体而言，这些发现表明，产前暴露于EGCG可能通过脂质合成、氧化、储存和运输过程的改变导致肝脏中脂质积累减少。
图5 产前EGCG暴露降低了成年后代小鼠的肝脏脂质。（A）肝油红O染色结果。比例尺：50 μm。n=每组4只小鼠。（B）雄性和雌性小鼠的肝脏TG含量。n=每组6只小鼠。（C，D）脂质生物学方面相关基因的热图。（E，F）与脂质代谢相关的几种DEGs的RT-qPCR。n=每组6只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p< 0.05，**p<0.01，***p<0.001。
6. 成年后代产前EGCG暴露导致的多层次分子改变
该研究在生物分子之间建立了拓扑网络，如图6A所示。然后，该网络在雄性中分为五个集成集群（iClusters1-5）和在雌性中分为四个集成集群（iClusters1-4）。我们在雄性和雌性中都发现了相同的12条通路，如图6B所示。在成年雄性中，iCluster1由64个基因和5个代谢物组成，与淀粉和蔗糖代谢相关。iCluster2由33个基因和10个代谢物组成，包含与胰高血糖素信号通路相关的通路。iCluster3由68个基因和8个代谢物组成，与视黄醇代谢相关。iCluster4由84个基因和4个代谢物组成，与FoxO信号通路和谷胱甘肽代谢相关。最后，iCluster5由79个基因和11种代谢物组成，包含参与精氨酸生物合成的途径。在成年雌性中，iCluster1由64个基因和5个代谢物组成，与精氨酸生物合成相关。iCluster2由33个基因和10种代谢物组成，也包含与精氨酸生物合成相关的途径。iCluster3由47个基因和5个代谢物组成，与IL-17信号通路有关。最后，iCluster4由100个基因和3个代谢物组成，与Rap1信号通路和类固醇激素生物合成相关。表S4和S5描述了从综合组学分析中得出的所有途径。这些发现强调了各种分子途径和代谢物，这些途径和代谢物因产前暴露于EGCG而改变，并揭示了观察到的小鼠肝脏脂质代谢改变的潜在机制。
图6 数据驱动的多组学集成。（A）利用代谢组学（圆形）和转录组学（三角形）分析生物分子的整合网络。这些簇由高度相关的生物分子组成，并通过颜色进行区分。（B）整合簇群中的路径由圆圈大小和颜色饱和度描述，表示-log(p-value (P))。
7. EGCG影响Ppara的启动子甲基化
为了探究糖脂代谢相关基因转录改变的原因，本研究分析了肝脏中几个基因的启动子甲基化。具体而言，我们选择了基因Ppara、Pparg、Pnpla2、Acacb、Ern1、Xbp1、Itch和Ndufa10进行分析。结果显示，肝脏中Pparg、Pnpla2、Acacb、Ern1、Xbp1、Itch和Ndufa10的甲基化水平无明显改变。然而，产前暴露于EGCG导致雄性和雌性的Ppara甲基化水平显著升高（图7A，B）。此外，Pearson分析显示Ppara的启动子甲基化与其转录之间存在负相关（图7 C，D）。这些发现表明，Ppara转录的改变可能是由于其启动子甲基化水平的变化，这可能是糖脂代谢变化的潜在机制。
图7 成年后代小鼠肝脏中与糖脂代谢相关基因的DNA甲基化水平。（A）成年雄性参与糖脂代谢的基因启动子区域甲基化水平。（B）成年雌性参与糖脂代谢的基因启动子区域甲基化水平。成年雄性（C）和雌性（D）的Ppara mRNA水平与Ppara启动子DNA甲基化水平的相关性。数据是标准差±平均值（n = 6，每次处理4只母鼠，每只母鼠1-2只后代）。**p<0.01采用双尾非配对t检验。
与成人接触化学物质相比，发育早期接触化学物质往往会产生更严重和更持久的不良影响。因此，为了保障公众健康，探究发育阶段暴露以及暴露终点相关毒性不良后果的潜在分子机制至关重要。肝脏作为参与宿主代谢的重要器官，将血清ALT和AST水平作为肝脏损伤的临床指标。在EGCG暴露组中，我们观察到ALT和AST水平升高。组织病理学研究显示EGCG组出现肝细胞炎症和纤维化。因此，我们的数据引起了对成年小鼠产前摄入EGCG对后代小鼠肝脏代谢的潜在影响的关注。
据我们所知，这项研究首次利用多组学分析证明产前暴露于EGCG会影响成年小鼠的肝脏代谢。本研究根据肝脏代谢组学结果确定了对氨基酸代谢的显著影响，包括甘氨酸、谷氨酸和精氨酸。氨基酸及其代谢物对于构建多肽和蛋白质结构、支持人类和动物的生长、维持、繁殖和免疫至关重要。甘氨酸是中枢神经系统中的抑制性神经递质，其产物谷胱甘肽是调节细胞自由基稳态的主要抗氧化剂。丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸在细胞特异性营养代谢、细胞信号传导和氧化应激中起关键作用。代谢谱分析不仅揭示了代谢物水平的变化，而且提供了对受毒性外源性物质影响的代谢过程的全面解析。在这项研究中，产前暴露于EGCG显著影响了小鼠肝脏中能量代谢相关的代谢物，包括葡萄糖、乳酸、柠檬酸盐、谷氨酸和苹果酸。柠檬酸盐是TCA循环的重要组成部分，该循环是细胞能量产生的重要途径。与丙酮酸代谢相关的代谢物如丙酮酸、丙氨酸和乳酸也起着重要作用。丙酮酸盐是糖酵解的产物，可转化为柠檬酸盐合成的前体。产前EGCG暴露对糖酵解和糖异生等能量代谢途径的影响从丙酮酸、柠檬酸盐和乳酸水平的增加中可以看出。葡萄糖、乳酸和柠檬酸盐水平升高可能表明产前EGCG暴露后肝脏代谢受损。代谢组学分析表明碳水化合物代谢发生了显著变化。
慢性炎症在代谢疾病的启动和进展中起着关键作用。产前暴露于EGCG的成年小鼠中，肝脏IL-6水平随着纤维化的发生而升高。纤维化表明肝脏疾病加重，其特征是胶原过度积聚。值得注意的是，产前EGCG暴露显著刺激了成年小鼠肝纤维瘢痕的形成，α-Sma和胶原蛋白III表达水平较高。NAFLD的病因复杂，受肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症和性别等多种因素的影响。然而，这项研究发现，产前暴露于EGCG可减少后代成年小鼠的肝脂质积累，而AST和ALT活性升高与肝损伤有关。EGCG可显著提高成年小鼠的ALT和AST酶活性，提示其对肝功能有潜在影响。
糖原是能量储存和利用的主要形式，它通常被认为是细胞中能量存储和利用的首选。我们的研究结果表明，在产前EGCG刺激后，肝脏中参与糖原代谢的基因显著上调。葡萄糖（一种碳水化合物衍生的前体）以及糖异生前体（如乳酸或丙氨酸）促进糖原合成。葡萄糖6-磷酸在转运过程中起着至关重要的作用，并直接激活糖原合酶。我们观察到肝脏G6P表达的上调，这增强了糖异生并与肝糖原含量升高相关。值得注意的是，糖原的过度累积已被证明会促进巨噬细胞的炎症。糖原代谢的调节是调节炎症反应和慢性炎症性疾病的关键，而炎症反应本身可能受炎症因子的影响。与人类肥胖相关的炎症相关代谢应激通常表现为脂肪组织中糖原的异常处理。我们的研究表明，在产前发育期间暴露于EGCG诱导的糖原含量增加可能有助于炎症的产生。
此外，我们对脂质代谢和基因表达的分析揭示了涉及多种信号通路的复杂分子机制，这些信号通路是产前EGCG暴露导致肝毒性的基础。通过比较单个组学数据集，我们确定了特定于雌性iCluster1和雄性iCluster4样本特有的不同整合组学通路。谷氨酰胺和谷氨酸代谢的失调在这些集群中尤为明显。谷氨酸在肝脏内具有多种功能，包括作为尿素生成、肝糖异生、神经递质合成、核苷酸/核酸合成和谷胱甘肽产生的前体的底物。许多功能与谷氨酰胺转化为谷氨酸密切相关。我们的研究结果表明，EGCG暴露可能会破坏这一过程，导致肝脏葡萄糖代谢异常。雄性和雌性iCluster4样本均表现出Rap1信号通路的参与，该信号通路与shelterin复合体成员TERF2IP相关，在保护哺乳动物端粒中起着至关重要的作用。人类RAP1已被证明可以增强NFκB依赖性炎症基因的表达，并且还可以调节端粒以外的代谢途径。抑制Rap1会导致肝和脂肪功能障碍，从而导致葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和过量脂肪堆积。组织病理学检查显示雄性和雌性小鼠肝组织中的脂质含量显著降低。因此，产前暴露于EGCG可能会通过调节Rap1信号通路来干扰脂肪酸和葡萄糖代谢。本研究综合组学分析全面了解了产前EGCG暴露如何影响成年小鼠肝脏的降脂效果。
转录组和代谢组分析的结果主要集中在与糖原合成和脂质代谢相关的基因和代谢物的调控上。综合组学揭示了EGCG破坏Rap1信号通路、炎症和谷氨酰胺连接通路的多种机制，从而解释了观察到的改变和肝毒性。尽管综合组学分析在探索与发育性肝毒性相关的决定性途径方面更有效，但仍需要进一步研究来阐明潜在的机制。
产前EGCG处理后，糖脂代谢基因Ppara、Pparg、Pnpla2、Acacb、Ern1、Xbp1、Itch、Ndufa10的表达水平发生变化。然而，除了Ppara启动子甲基化状态改变外，EGCG对这些基因的启动子甲基化状态没有影响。PPARα降低有助于NAFLD的发展。据报道，抑制活性PPARα可减少炎症、肝损伤和纤维化，但不会改善脂肪酸β氧化或脂质积累。在这项研究中，EGCG增加了Ppara启动子区域的DNA甲基化水平。Ppara转录水平降低使后代更容易发生肝脏炎症和纤维化。甲基-CpG结合蛋白可与Ppara的启动子区域结合并调节其转录活性。需要进一步的研究来了解EGCG如何针对不同的调控机制来改变Ppara的启动子甲基化状态。
综上所述，产前暴露于EGCG会影响肝功能导致炎症，同时诱导成年小鼠肝脏中糖原和脂质代谢的变化。这些发现引起了人们对怀孕期间摄入EGCG食品补充剂的关注。
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.129491
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