酱油是一种以大豆为主要原料的传统发酵调味品，其加工工艺主要包括传统日晒夜露发酵、高盐稀态发酵和低盐固态发酵3种。广式酱油作为中式酱油华南地区的代表，其通常采用高盐稀态发酵工艺自然发酵制成，即在高盐微酸的开放环境中经过制曲、酱醪发酵、压榨出油、调配灭菌等步骤制成成品酱油，而已发酵成熟的酱醪经压榨过滤出的油被称为“原油”。原油是成品酱油的基础，酱油的香气及滋味主要源于原油。高盐稀态发酵酱油通常由多种耐盐微生物协同发酵3～6 个月，其分泌的丰富酶系将体系中的大分子物质降解成氨基酸及还原糖，同时产生酯、酸、醛、酚等风味物质，使酱油酱香浓郁，风味独特。但是季节性变化引起的环境温度差异导致不同批次发酵的酱油品质稳定性欠佳。
佛山科学技术学院食品科学与工程学院的于茜雅、鲁骞、黄桂东*等从模拟四季环境温度出发，通过监测不同发酵温度原油理化指标变化，分析原油风味物质含量差异，确定影响风味的主要差异标志物，并结合感官评分评定原油品质，将有利于提升广式酱油品质的稳定性。
1 酱醪发酵过程中温度变化
此次小试发酵从11月末起至次年1月，该时期室内温度变化范围为20～25 ℃，自然发酵样品于通风良好的室内发酵。4 种温度发酵的酱醪样品中心温度变化如图1所示，该数据为后续酱油理化指标、游离氨基酸组成及风味物质等变化提供了依据。
2 发酵温度对原油pH值和总酸的影响
由图2可知，发酵温度对原油的pH值影响显著（
P＜0.05）。在整个发酵过程中原油的pH值呈持续下降趋势，且在4个原油样品中HT样品的pH值最低，LT样品的pH值最高。这可能是因为HT样品发酵温度为37 ℃，该温度条件下适宜乳酸菌生长繁殖，乳酸菌代谢产生大量有机酸 ，使发酵体系pH值大幅度下降。4个样品的总酸整体呈上升趋势，其原因可能是原料中的蛋白质和脂肪被米曲霉酶系水解及其他微生物的共代谢作用，使有机酸、谷氨酸和脂肪酸等酸类物质在体系中大量生成 。HT样品和LT样品在发酵过程中总酸含量持续上升，其中HT样品在发酵60 d的总酸含量最高，达到1.51 g/100 mL。MT样品和NT样品在发酵15 d总酸增速减缓，25 d总酸含量略有下降，35 d又缓慢上升，这可能由于发酵15 d起体系中的酸类物质与醇发生酯化反应 ，促使总酸含量下降，发酵后期由于体系中芽孢杆菌的作用使得总酸含量略有上升 。总体而言，37 ℃发酵有利于原油体系中总酸的生成，相对较高的温度赋予了酱油酸味形成的物质基础。
3 发酵温度对原油中氨基酸态氮含量的影响
由图3可知，按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中的酱油等级评价标准 ，发酵末期4 个样品的氨基酸态氮质量浓度均高于0.8 g/100 mL，已达到特级酱油标准。随着发酵时间的延长，氨基酸态氮含量整体呈上升趋势。酱醪发酵前期，发酵温度对原油中氨基酸态氮含量影响极显著（
P＜0.01）；而发酵末期，温度对原油中氨基酸态氮含量的影响不显著。这可能由于一定程度的高温可促进米曲霉蛋白酶酶解，且酱醪发酵前期微生物分泌的蛋白酶活力强 ，加速了原料中蛋白质转化为氨基酸，且乳酸菌的胞外蛋白水解也可生成游离氨基酸 。但随着发酵的进行体系pH值下降，蛋白酶活力逐渐降低，且发酵中期微生物处于相对优势生长阶段，其代谢会消耗部分氨基酸并转化为风味物质 ，致使发酵后期氨基酸态氮上升趋势变缓。发酵温度越高，原油初始氨基酸态氮含量越高，HT初始氨基酸态氮质量浓度可达到0.84 g/100 mL，LT的初始氨基酸态氮质量浓度仅为0.42 g/100 mL，但在整个发酵时期中，LT样品的氨基酸态氮生成速率最高，发酵结束其质量浓度升至0.98 g/100 mL。相比其他发酵温度，一定程度的低温可延长蛋白酶催化水解时间 ，使发酵末期其氨基酸态氮含量与其他体系基本持平。因此，温度变化对发酵末期原油氨基酸态氮含量无明显影响。
4 发酵温度对原油中还原糖含量的影响
由图4可知，发酵温度对体系中还原糖含量的变化影响显著。发酵初期，原料被淀粉酶水解生成大量葡萄糖、果糖等还原糖 ，此时4 个样品的还原糖含量均呈上升趋势。LT和NT样品在整个发酵过程中均为上升趋势，而HT样品和MT样品在发酵中期还原糖含量出现明显波动，其中MT样品在发酵至25 d还原糖含量开始下降，发酵至60 d低至4.36 g/100 mL，与其他3 个样品差异显著（
P＜0.05），产生这种差异的原因可能是30 ℃发酵体系中酵母菌等微生物代谢旺盛，将大量还原糖转化为醇类及酸类物质 ，使还原糖的消耗率大于生成率。HT样品在发酵后期还原糖含量略有提升，推测在前期乳酸菌的活跃使体系pH值降低，当pH值较低时会促淀粉酶的活力 ，将未发酵完全的原料进行进一步酶解，使还原糖的生成率增加。上述研究表明，中温30 ℃发酵促进体系中微生物对还原糖的利用率，有利于原油风味物质的形成。
5 发酵温度对原油中游离氨基酸含量的影响
如表2所示，酱醪发酵至60 d，原油HT、MT、LT和NT样品总游离氨基酸质量浓度依次为6.542、6.968、6.820 g/100 mL和6.374 g/100 mL，且发酵温度对不同原油中各游离氨基酸含量（除缬氨酸）影响显著（
P＜0.05），其中MT样品总游离氨基酸含量最高，可能由于该条件下可参与水解蛋白质和多肽的酶活力较强 ；HT样品由于高温促进美拉德反应消耗氨基酸 ，从而降低了总游离氨基酸含量。MT样品的鲜味氨基酸总含量高于其余3 组，LT样品谷氨酸含量最高，达到了1.264 g/100 mL，但除组氨酸和精氨酸外，其余苦味氨基酸含量在LT样品中均为最低水平，MT组苦味氨基酸含量比LT组提高了4.08%，推测温度是影响苦味氨基酸形成的关键因素。苦味氨基酸含量高不等同于样品苦味厚重。酱油发酵体系复杂，多种呈味物质共同作用构成酱油鲜美醇厚的滋味。甜味氨基酸中，MT样品中丝氨酸和LT样品中苏氨酸含量较高，而HT样品苏氨酸含量低，这可能由于丝氨酸和苏氨酸会参与乳酸菌及其他细菌的代谢。NT样品的鲜味氨基酸、甜味氨基酸及苦味氨基酸均处较低水平。上述研究表明：自然发酵相对不利于游离氨基酸的形成，而高温发酵会促进体系中游离氨基酸的利用。
6 发酵温度对原油风味物质形成的影响
6.1原油挥发性风味物质组成定量分析
采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对4 种温度条件发酵的原油中的挥发性风味物质进行分析，共检测出234 种挥发性风味物质，将其分为9 大类： 醇、酯、酮、醛、酸、酚、含硫化合物、呋喃（酮）和吡嗪。 包括醇类34 种、酯类61 种、酮类48 种、醛类29 种、酸类20 种、酚类7 种、含硫化合物2 种、呋喃（酮）类20 种、吡嗪类7 种以及其他化合物6 种。 根 据挥发性风味物质数量（图5a）来看，HT样品与其他样品相比吡嗪及醛酮类物质种类较多，而醇类物质种类较少；MT样品中醇类及酸类物质种类高于其他3 个样品；LT样品除醇类物质外，其他风味物质数量均处于低水平；NT样品风味物质数量与其他样品差异不显著。
根据挥发性风味物质含量（图5b）来看，MT样品的挥发性风味物质总含量最高，LT样品风味物质总含量最低。HT样品中醇类及酚类物质含量较少，而含硫化合物及吡嗪类物质含量高；MT样品中醇类及酚类物质含量高；LT样品呋喃（酮）类物质含量丰富；根据不同温度发酵的原油中挥发性风味物质变化结果可以发现，原油发酵的温度与挥发性风味物质的含量及组成有着密切的关系，因此可以通过改变酱醪发酵的温度改善原油的风味。
6.2原油特征性风味物质热图聚类分析
为了探究4 种原油样品风味物质的差异，将4 种样品中检测到的物质与文献报道的特征性风味物质进行比对，将其含量标准化后聚类分析，并以热图形式展示（图6）。
醇 类物质是形成原油风味的主要挥发性化合物，在9大类化合物中含量最高。4 个样品中，MT样品最易形成乙醇以及部分高级醇，这与MT样品中酵母菌消耗大量还原糖有关，其通过Ehrlich途径代谢生成高级醇 。MT样品生成的异戊醇、3-戊醇、3-甲硫基丙醇和1-辛烯-3-醇等醇类物质处于较高水平，异戊醇具有麦芽香气；3-戊醇呈甜香；3-甲硫基丙醇具有烤土豆香气。1-辛烯-3-醇赋予原油蘑菇香气，为酱油中的特征性醇类物质，其含量在MT中约高于其他样品的3～9 倍。HT样品中具有玫瑰香气的苯乙醇含量较高，同时NT样品也含有少量高级醇，但LT样品中大部分高级醇均处于较低水平。
酸类物质的含量与发酵末期原油总酸（图2）趋势基本一致，HT样品总含量最高，以2-甲基丁酸、异丁酸（奶酪香）为主的酸类化合物可能使高温样品酸性较强。 酸类物质又可与高级醇发生酯化反应形成酯类化合物。 酯类是表征酱油中花果香的重要风味物质，可以中和酱油的鲜味，使香气更加醇厚饱满 。 在30 ℃发酵环境下，酵母菌作用促进了MT样品中多种酱油特征性酯类化合物的形成，如乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等，可赋予原油清甜的花果香气。
醛酮类及吡嗪类化合物主要通过美拉德反应生成 。 结果表明，HT样品中含有大量的醛酮类及杂环化合物，而LT样品则处于较低水平，有研究表明醛类物质也可由异亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸等氨基酸促进生成 ，这可能是造成LT样品醛类物质含量较少的主要因素之一。 酚类物质在MT样品中占比最高，以呈麦芽香的2-甲基丁醛为主的醛类物质可在酵母作用下进一步生成产生烟熏香的酚类物质 。 吡嗪类物质如2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等主要呈坚果香、焙烤香； 呋喃（酮）类物质如糠醛及5-羟甲基糠醛（HMF）等可赋予焦糖香气，二者共同为HT样品提供酱香风味形成的物质基础。 综上所述，不同温度发酵的原油挥发性风味物质差异较大，HT样品中大量的美拉德反应产物可为原油提供酱香风味形成的物质基础； MT样品由于酵母菌的代谢作用使其醇类、酯类及酚类物质极为丰富，使原油风味呈现酯香浓郁且醇厚柔和； 而LT样品中大量醛酮及吡嗪类物质的缺失，造成原油酱香不足。
6.3原油挥发性风味物质OPLS-DA模型分析
为了进一步探究发酵温度对原油风味的影响，从234 种挥发性风味物质中筛选出差异显著的风味物质（
P＜0.05），再利用OPLS-DA模型监督分析并量化4 个样品间的差异程度，选出变量重要性投影（VIP）大于1的差异代谢物。经OPLS-DA计算出 和 和
Q2分别为0.962、0.998、0.989，其中 和 接近1证明该模型拟合度较好，且
Q2＞0.5表明模型有较好的预测能力，因此该模型可以用来分析组间差异标志物。
从图7可看出，LT样品和NT样品距离较近，而与HT和MT样品间隔较远，这证明低温发酵和自然发酵的原油风味物质及含量较为相似，而高温发酵、中温发酵和低温发酵3 种样品风味成分及含量差异较大。根据筛选结果看VIP值大于1的差异代谢物共33 种（图8），包括醇类6 种、酸类3 种、酯类8 种、醛类3 种、酮类6 种、酚类2 种、呋喃类4 种、吡嗪类1 种。MT样品中差异代谢物种类最多且部分化合物含量显著高于其他样品，包括具有蘑菇香气的1-辛烯-3-醇、呈果香的乙酸甲酯及乳酸乙酯、具有奶油香气的3-羟基-2-丁酮等，上述物质均为文献中报道的酱油特征性风味物质，而这可能成为其他3 种样品风味缺失的关键因素。
7 感官评价
图9表明，感官评价综合评分MT样品得分最高，较NT样品总分提升了4.8%，其原因可能是该原油样品中酱油特征性风味成分较为丰富，如1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯以及HMF等赋予原油浓郁的酱香酯香，且各呈味氨基酸的结合使其滋味鲜美。HT样品口感和气味与MT样品相比，分别下降了3.18%和5.4%，结合前面结果可知：醛酮类及吡嗪类化合物过多，且体系总酸含量较高，致使样品产生焦糊味且酸味过重。LT样品综合得分最低，与MT相比降低了12.52%，这与前面结论相符。由于LT样品挥发性物质总含量最低，且在15 ℃低温发酵条件不利于发生美拉德等褐变反应致使原油样品酱香味缺失，结合香气-滋味交互作用可推测关键风味缺失为样品口感不佳的因素之一。因微生物对还原糖未充分利用，形成风味的物质基础较少，故NT样品香气得分较低。总体而言，30 ℃控温发酵对原油的口感、色泽及整体风味有较大提升。
8 结论
通过控制酱油发酵温度，分析不同温度条件发酵的原油样品中pH值、总酸、还原糖、氨基酸态氮含量变化趋势，分析发酵60 d原油游离氨基酸组成以及挥发性风味物质含量差异。结果表明：自然发酵的原油游离氨基酸生成率较低；高温37 ℃发酵的原油具有美拉德反应及酱香味形成的物质基础（酸类及吡嗪类），但不利于发酵末期游离氨基酸的形成且气味不佳；30 ℃发酵具有形成醇厚柔和风味的物质基础（醇类及酯类），游离氨基酸生成量最高，且原油感官评分最佳；低温15 ℃发酵的原油虽易形成鲜味氨基酸及甜味氨基酸，风味物质基础较差且感官得分最低。综上，30 ℃控温发酵的原油品质风味最佳。该研究虽探究了不同温度发酵的原油品质差异，但目前影响原油品质的机理尚不明确，后续研究需将酱醪体系中的微生物与相应原油中各理化指标结合分析，进一步探究环境温度对原油品质的影响机制，为优化酱油酿造工艺提供参考。
本文《温度对广式高盐稀态酱油原油品质的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第22期55-63页，作者：于茜雅，鲁 骞，吴昌正，王阿利，黄桂东。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230118-141。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；北京林业大学生物科学与技术学院 栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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