目前2型糖尿病的治疗方式包括服用降糖药物和注射胰岛素。部分口服药物可作为α-淀粉酶抑制剂，抑制酶活性，阻断淀粉水解，调控血糖水平。然而药物治疗具有副作用大、价格昂贵、患者依从性差等缺点，因而寻找来自天然产物、安全有效的α-淀粉酶抑制剂很有必要。 近年来，食源性降糖肽显示出良好的研究前景，多种植物已被证明能够产生 α -淀粉酶抑制肽，调控血糖水平。在众多植物中，绿豆蛋白具有含量高、提取方式简单等优势。已有研究证明，食用绿豆蛋白可以有效改善糖脂代谢。

江南大学食品学院的李永富、王雅茹、黄金荣等采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白（清蛋白、球蛋白、谷蛋白），以α-淀粉酶活性抑制率为主要指标，筛选蛋白水解组分进行深入研究，然后采用凝胶过滤柱层析（GFC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对其进行分离纯化，最后采用纳米液相色谱-串联质谱（Nano LC-MS/MS）鉴定出具有α-淀粉酶抑制效果的绿豆蛋白肽序列，以期为绿豆的降血糖活性提供更多依据。

1 绿豆蛋白及其分级蛋白的提取

表1显示：绿豆蛋白的纯度最高，为94.24%，其次分别是绿豆清蛋白（84.71%）、绿豆谷蛋白（81.89%）、绿豆球蛋白（75.71%）和绿豆醇溶蛋白（3.11%）。结果发现在分级蛋白中含量最高的是清蛋白。因为绿豆蛋白中所含的醇溶蛋白较少，且乙醇提取物中会掺杂其他极性成分，因此醇溶蛋白不作为本实验研究对象。

2 绿豆蛋白及其分级蛋白肽对α-淀粉酶抑制效果

采用胃-胰蛋白酶连续水解绿豆蛋白及其分级蛋白（绿豆清蛋白、球蛋白、谷蛋白），并测定其肽对α-淀粉酶活性的抑制率，结果如图1A所示，相同质量浓度下（4 mg/mL），绿豆蛋白及其分级蛋白肽均对酶有抑制效果，但与阿卡波糖相比抑制率低（图1B）。其中绿豆蛋白肽对酶的抑制率最高，为16.51%。3个分级蛋白中，清蛋白肽和谷蛋白肽的抑制率较高，分别为12.59%和13.33%（P＞0.05），球蛋白肽抑制率最低，为8.78%。

3 绿豆蛋白及其分级蛋白的水解程度分析

为了对比绿豆蛋白及其分级蛋白的水解程度，探究它们在α-淀粉酶活性抑制方面产生差异的原因，本研究测定4 种蛋白的水解度及其水解前后的分子质量，结果如图2所示。图2A显示，4个蛋白水解度按照降序排列依次是绿豆蛋白（6.28%）、绿豆清蛋白（6.02%）、绿豆球蛋白（5.31%）和绿豆谷蛋白（5.20%）。这表明，蛋白的水解度与其肽对α-淀粉酶的抑制率呈正相关，水解程度越高，分子质量越小，对α-淀粉酶活性的抑制率也越高，但谷蛋白可能由于溶解度低而致使水解度较低。

蛋白水解前后分子质量分布采用SDS-PAGE测定。由图2B可知，绿豆蛋白的电泳条带出现在60、50、28、23 kDa。经过水解后，绿豆蛋白肽在20 kD a以下出现均匀连续且颜色清晰的条带，表明绿豆蛋白中的大分子蛋白被水解为小分子蛋白和肽，与之相对应的是绿豆蛋白的水解度和其肽对 α -淀粉酶活性的抑制率最高。绿豆清蛋白和球蛋白的电泳条带分别出现在56、37～50、26、24、20 kDa和50、20～25、15 kDa。水解后，绿豆清蛋白和球蛋白的肽在10～50 kDa之间出现连续条带，表明与绿豆蛋白相比，它们水解不完全，仍有少部分大分子蛋白未被水解，与之对应的是两种蛋白的水解度以及它们的肽对 α -淀粉酶活性抑制率较低。绿豆谷蛋白仅在50 kDa处出现一条电泳条带，可能是其溶解度低，导致其含量低。水解后，绿豆谷蛋白肽的分子质量没有明显变化，同样在50 kDa处出现一条条带，但是相比于水解前，条带细且色浅，表明有部分大分子蛋白被水解，所以其水解度最低。综上所述，仅有绿豆蛋白被全部水解成分子质量小于20 kDa的肽段，与其高水解度以及其肽对 α -淀粉酶活性的高抑制率结果相对应，该结果支持了小分子肽对 α -淀粉酶具有高抑制率的理论。

4 绿豆蛋白及其分级蛋白中的氨基酸组成

测定蛋白的氨基酸组成及质量分数，结果如表2所示。4 个蛋白的氨基酸组成及质量分数具有明显差异，其中精氨酸含量按照降序排列依次是绿豆蛋白（7.23%）、清蛋白（6.48%）、谷蛋白（4.07%）、球蛋白（3.91%），芳香族氨基酸含量按照降序排列依次是绿豆蛋白（8.73%）、清蛋白（7.92%）、谷蛋白（5.95%）、球蛋白（5.68%），疏水氨基酸含量按照降序排列依次是绿豆蛋白（32.68%）、清蛋白（29.32%）、球蛋白（23.02%）、谷蛋白（20.77%）。有研究表明，精氨酸、芳香族氨基酸、疏水氨基酸的高含量与强生物活性功能相关，包括高抗氧化、脂肪酶抑制、α-淀粉酶抑制活性。因此绿豆蛋白中的高精氨酸、芳香族氨基酸和疏水氨基酸含量，可能是其肽具有高α-淀粉酶抑制活性的原因之一。此外，同3 个分级蛋白相比，绿豆蛋白中含有更多的苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸残基等胃-胰蛋白酶的切割位点，因此绿豆蛋白的水解程度最高，这有助于提升其肽对α-淀粉酶活性的抑制效果。

5 绿豆蛋白肽的纯化与鉴定

5.1 GFC测定结果

选择α-淀粉酶抑制活性最强的绿豆蛋白肽进行进一步纯化，结果如图3A所示，经过纯化，绿豆蛋白肽被分为3 个组分（F1、F2、F3）。在相同质量浓度下（0.18 mg/mL），3 个组分对α-淀粉酶活性的抑制率均显著高于水解液（图3B）。其中抑制率最高的组分是F3，为16.80%，显著高于其他组分）。测定3 个组分中肽的分子质量，结果如图3C～E所示，分子质量范围为F1（3～7 kDa）＞F2（1～3 kDa）＞F3（小于1 kDa）。分子质量是影响肽生理活性，包括α-淀粉酶抑制活性的重要因素之一，小分子质量的肽更易抑制α-淀粉酶活性。因此，选择F3组分进一步纯化。

5.2 RP-HPLC测定结果

采用Waters Xbridge Prep C18柱F3组分进一步纯化，根据时间收集得到如图4A所示的3 个组分（F3-1、F3-2、F3-3），测定对α-淀粉酶活性的抑制效果。结果如图4B所示，相同质量浓度下（0.18 mg/mL），3 个组分对α-淀粉酶活性的抑制效果具有显著差异。F3-1不仅不能抑制α-淀粉酶活性，反而促进了α-淀粉酶对淀粉的水解，推测原因可能有两点，一方面是先出峰的物质疏水性差，分子质量大，难以与α-淀粉酶的活性中心结合，从而无法对其产生抑制作用；另一方面是先出峰的物质极性强，表面电荷分布不均匀，其中与α-淀粉酶带同种电荷的肽段与酶形成一定距离时可能对其产生了微弱的斥力，使其能更好地发挥催化活性，从而促进了酶对淀粉的消化。而F3-2和F3-3组分均对α-淀粉酶活性产生了抑制作用，抑制率分别为11.40%和23.37%。其中F3-3组分对α-淀粉酶活性的抑制作用最强。这表明疏水性是影响肽对α-淀粉酶抑制效果的重要因素之一，疏水性越强，肽对α-淀粉酶的抑制率可能也就越强。因此，选择F3-3组分鉴定肽序列。

5.3 Nano LC-MS/MS测定结果

通过GFC和RP-HPLC将绿豆蛋白水解物分离纯化，得到了对α-淀粉酶活性有最高抑制作用的F3-3组分，通过Nano HPLC-MS/MS对其肽序列进行鉴定。经过置信度（＞50%）、生物活性评分（＞0.8）、疏水性数值（＞0.5）后及BIOPEP数据库查重后，得到32 条肽序列，其中17 条为本研究首次发现。如表3所示，F3-3中检测得到的肽序列的分子质量基本分布在0.3～1.0 kDa。刘欢分离纯化得到的茶籽粕α-淀粉酶抑制肽的分子质量范围同样主要分布在0.3～1 kDa。这一结果表明肽的分子质量与肽的生物活性密切相关，小分子肽能够与α-淀粉酶活性中心残基形成稳定的氢键结合，抑制活性更好。同时，疏水性也在肽对α-淀粉酶活性的抑制中发挥了重要作用，相关研究表明，含有更多疏水氨基酸，如苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L）残基的肽序列，具有抑制α-淀粉酶活性的潜能，F3-3组分的强抑制活性可能与此相关。此外，Ngoh等对豆类中的α-淀粉酶抑制肽的研究结果表明，存在特定二肽（PP、LL、YY）组合的α-淀粉酶抑制剂具有更高的潜力，与本研究中的肽序列（ILLLLCCF、LLLLLLILFLPMLL、LLAF、ILLLIFPF）一致。

生物活性肽的另一个重要特性是氨基酸残基在肽序列中的位置。相关研究表明，C/N末端存在亮氨酸（L）或苯丙氨酸（F）残基的肽序列具有更高的α-淀粉酶活性抑制潜力，这可能与肽和α-淀粉酶残基之间的芳香族-芳香族残基相互作用形成的氢键、静电力和范德华力与肽对α-淀粉酶活性的抑制作用密切相关，本研究中的肽序列（LILLLLF、LIF、LAFL等）也符合这一规律。因此，结合过往诸多研究，本研究所发现的绿豆蛋白肽具有良好的α-淀粉酶活性抑制效果，有助于为绿豆蛋白在防治糖尿病方面提供新的依据。

结 论

在本研究中，通过胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白（清蛋白、球蛋白、谷蛋白），发现绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高（16.51%）。这可能与绿豆蛋白的水解度和疏水氨基酸含量较高有关，进一步对绿豆蛋白肽进行分离纯化与肽序列鉴定，发现了32 条具有α-淀粉酶活性抑制潜力的肽，其中17 条是首次发现，这为绿豆的降血糖活性提供了科学依据。

作者简介

李永富副教授

江南大学 食品学院

李永富， 男，副教授，硕士 研 究生导师，国 药集团 ·江南大学健康主食联合研究中心主 任。 主要从事食品大 健康领域的 全谷 物营养工程技术研究及产品开发工作。 采用创新的思维和技术提高全谷物活性因子生理利用率、食 用品质，致力于改善主食营养健康，减少因食用过细过精导致的慢性营养代谢疾病高发现状。 重点研究糙米、黑米、发芽米、青稞、豆类的食用品质改良，改善其口感、蒸煮品质及营养健康功效，这些研究成果已经在企业进行了产业化生产。 高血糖人群专用主食是目前研究重点，目的是研发出一种适口性好、连食性好的低血糖指数主食产品，解决高血糖人群因食用白米饭后餐后血糖快速升高而不敢 吃饭的苦恼，改善其生活品质。 让高血糖人群开心吃饭、放心吃饭是本研究的初心。

最近几年，主持国家“十三五”重点研发计划项目任务2项，主持中央财政农业推广项目1项，参与国家粮食局粮食公益项目2 项、主持了江苏省科技攻关项目1 项、市科技创业项目1项，企业合作项目10多项，到账科研经费700多万元。注重科研技术的社会需求，擅长科技成果产业化，与企业合作紧密 。

本文《绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定》来源于《食品科学》2024年45卷1期58-64页. 作者：李永富，王雅茹，黄金荣，史锋. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230314-141. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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