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概述
佐剂，也称为免疫调节剂或免疫增强剂，是疫苗的一种添加剂。佐剂属于非特异性免疫增强剂，可以增强或改变对抗原的免疫反应类型。佐剂不仅可以帮助抗原在体内诱导长期有效的特异性免疫反应，从而实现更高的疫苗效力，延长免疫反应的保护时间，还可以减少抗原的使用量、生产成本和免疫次数。
根据其化学性质，佐剂大致可分为以下几类：无机佐剂如含铝佐剂；乳液型佐剂如MF59和AS03；水溶性佐剂如皂苷；靶向模式识别受体的佐剂如CpG；和细胞生成佐剂，如白细胞介素。佐剂与抗原的结合可以增加抗原的表面积，其生物学效应主要包括：（1）抗原库效应；（2）细胞因子和趋化因子表达的上调，免疫细胞在注射部位的募集；（3）炎症小体的激活；以及（4）载体效应。一方面，在佐剂作用下，抗原更有可能被抗原递呈细胞有效处理和呈递；另一方面，佐剂可以改变抗原的物理性质，从而导致抗原在体内的释放减慢，并延长抗原与免疫细胞之间的相互作用时间。
目前，已有数百种天然或合成化合物用于佐剂的研究，但批准用于疫苗的佐剂数量仍然有限。氢氧化铝（AH）和磷酸铝（AP）仍然主导着人类疫苗制剂的佐剂领域。然而，尽管含铝佐剂在增强疫苗免疫反应方面已经应用了近几十年，但含铝佐剂的作用分子机制仍未完全了解。因此，有必要加深我们对这些佐剂的物理、化学和生物特性的理解，为在临床开发阶段尽早确定每种佐剂的质量属性和选择合适的佐剂类型提供理论依据。
铝佐剂的种类
目前，获得许可的人类疫苗中包括的两种主要类型的铝佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。疫苗制剂中AH佐剂与AP佐剂的选择在很大程度上取决于抗原的性质和吸附以实现最佳免疫反应的要求。
氢氧化铝佐剂是通过在精心控制的条件下向铝离子溶液中加入氢氧化钠来制备的。温度、浓度和混合速度是影响所生产佐剂物理化学性质的因素。电子显微镜显示AH佐剂由形成松散微粒聚集体的纳米颗粒纤维组成。
磷酸铝佐剂是通过在磷酸盐存在下在碱性条件下沉淀铝离子来制备的。磷酸根离子的加入导致羟基磷酸铝Al（OH）x（PO4）y的形成，其中一定比例的羟基被磷酸根取代。AP佐剂是无定形的，即非结晶的，因为磷酸盐的掺入会干扰结晶过程。AP佐剂的超微结构显示初级球形纳米颗粒，直径约50 nm，通常形成松散的微粒聚集体。
无定形羟基磷酸铝硫酸酯（AAHS）是一种由默克公司生产的含铝佐剂，用于多种商业疫苗，包括Recombivax、Gardasil和Vaxelis。AAHS的零电荷点约为7，这意味着它在中性pH下不携带表面电荷。在超微结构上，它由类似于AP和明矾沉淀疫苗的片状纳米颗粒组成。因此，AAHS可以被认为是一种具有相对低的P∶OH比的不同形式的AP佐剂。
一些获得许可的疫苗，如Twinrix 和Infanrix Hexa，同时含有AH和AP佐剂。疫苗是通过将选定的抗原与AH或AP佐剂混合，然后通过最佳吸附组分的组合来制备的。电子显微镜显示纳米纤维的聚集体与片状纳米颗粒的聚集体相邻或偶尔与之混合，表明佐剂在混合时保持其主要颗粒结构。
铝佐剂的理化性质
有许多已建立的测定方法可用于表征铝佐剂并确保批次之间的一致性。结构信息可以使用X射线衍射（仅适用于AH佐剂）、光谱（傅里叶变换红外、核磁共振、拉曼）和透射电子显微镜获得。
颗粒度
铝佐剂通常由初级纳米颗粒组成，这些纳米颗粒形成尺寸为1至20μm的不规则形状的聚集体。颗粒大小和形状对免疫细胞通过吞噬作用摄取颗粒的效率具有重要意义。颗粒大小可以使用激光衍射、动态光散射或微流成像来确定。铝佐剂的表面电荷取决于pH值，随着静电排斥力的降低，当pH值接近零电荷点时，观察到较大的颗粒尺寸。同样，氯化钠的加入可以掩盖表面电荷并增强颗粒聚集。
表面电荷
AH纳米颗粒表面的铝离子与羟基配位，羟基可以接受或提供质子，这取决于分散介质的pH。因此，AH具有依赖于pH的表面电荷。它的零电荷点（PZC）为11.4，在中性pH下带正电荷。对于AP而言，由于铝对磷酸盐的亲和力更高，一部分表面羟基被磷酸盐取代。商业AP佐剂的P:Al比为1.1–1.15:1，PZC约为5，这使它们在中性pH下具有负表面电荷。较大比例的表面羟基导致较高的PZC。
表面积
根据使用重量FTIR光谱测量的水吸附，组成铝聚集体的初级纳米颗粒为佐剂提供了非常大的表面积，AH佐剂的表面积估计为514 m2/g。表面积也可以在氮吸附后使用Brunauer–Emmett–Teller（BET）理论来确定。虽然这些方法不能用于AP佐剂，但由50nm纳米颗粒组成的AP的超微结构表明，AP也具有非常大的表面积。
吸附
铝佐剂的大表面积允许对抗原具有高吸附能力，这可以用作佐剂表征的关键工具。重要的是，抗原的吸附会影响免疫反应的质量和程度，并可能增强或降低抗原的稳定性。应该注意的是，疫苗制剂中抗原的剂量通常较低，并且通常远低于完全吸附能力。吸附能力受抗原类型、缓冲液（pH、离子强度、组成）和其他赋形剂的影响，包括稳定剂或表面活性剂的存在。吸附的主要机制是抗原上的磷酸盐与佐剂上的表面羟基的配体交换，以及静电和疏水相互作用。
元素组成
铝佐剂中杂质的存在可以使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定。据报道，从不同制造商和不同批次获得的AH佐剂之间金属离子的类型和数量存在差异，这可能是由于生产过程中使用的铝盐、化学品和水的来源存在差异。一些污染物，如铜，可能会影响吸附抗原的稳定性。
铝佐剂与抗原结合的机制及分析表征
抗原通常可以通过氢键、范德华力、疏水作用、静电吸引和配体交换等方式吸附到含铝佐剂上，其中静电吸引最为常见。当佐剂和抗原分别具有相反的电荷时，吸附通常取决于静电吸引。在中性条件下，AP可以吸附带正电荷的抗原。
配体交换是抗原和佐剂之间最强的吸附，即使佐剂和抗原具有相反的电荷，也可能发生这种情况。当表面活性剂存在于疫苗制剂中时，抗原和佐剂之间的疏水作用增加，抗原和辅料之间的静电吸附减少。这些作用通常是诱导针对重组亚单位抗原和蛋白毒素的保护性免疫反应所必需的，并且需要根据抗原的特性筛选合适的佐剂。
对铝佐剂疫苗的质量控制：首先，需要了解铝吸附抗原的表面电荷性质，以预测疫苗悬浮液的物理性质；（2） 其次，测定铝吸附抗原的吸附速率和吸附强度，可以帮助我们了解铝佐剂对抗原的吸附能力，以及在不同条件下（如不同pH或离子强度）和长期储存的吸附能力；（3） 测定铝吸附抗原的解离动力学可以帮助我们了解抗原从铝佐剂中解离的速率以及在不同条件下（如不同温度或时间）解离的稳定性；（4） 最后，需要评估铝吸附抗原的免疫原性，这通常通过在动物模型中进行试验来测定。
铝佐剂的免疫刺激机制
贮库效应
在大多数情况下，疫苗产品中使用的抗原免疫原性较弱，可以通过与佐剂结合来增强免疫原性。吸附后，抗原积聚在佐剂颗粒的表面和内部，帮助抗原保持其物理和化学性质。大量研究表明，抗原可以与佐剂结合，在注射部位缓慢释放，持续刺激免疫系统，增强免疫反应，这就是贮库效应。
长期以来，疫苗注射部位的贮库效应一直被认为是免疫佐剂的主要作用机制之一。贮库效应受含铝佐剂的物理性质（表面积、电荷和形态结构）的影响。例如，更大的表面积可以增强抗原吸附，促进抗原储存，并促进抗原呈递到抗原呈递细胞（APC）。与含铝佐剂结合的抗原不仅有利于呈递给抗原呈递细胞，而且随着含铝佐剂的分解，抗原也会缓慢释放到组织中，导致抗原消耗的延迟，对免疫系统的刺激时间也会延长。此外，抗原和呈递细胞之间延长的相互作用间隔也增强了诱导的免疫反应。
免疫细胞的募集
肌肉注射后，铝佐剂可以刺激身体的先天免疫。先天免疫的主要参与者包括树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、碱性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、干扰素和补体蛋白。
AH和AP都激活单核细胞中的免疫系统相关途径，与AP相比，体外对AH的免疫反应更为明显。体内外实验证明，AH和AP在注射后可以募集不同种类的细胞并引发不同的免疫反应。将AH和AP佐剂抗原注射到小鼠肌肉中，注射部位的蛋白质组学分析显示，注射两种含铝佐剂后，注射部位附近67%的上调蛋白重叠，表明这两种佐剂在刺激免疫反应方面有一定的相似性。与AP相比，AH诱导了更多的免疫系统相关途径，免疫细胞在注射部位的募集为适应性免疫提供了有利的条件。
APC对抗原吸收的增强
诱导免疫应答的一个关键步骤是APC摄取抗原。铝佐剂吸附的抗原和细胞间质中游离的抗原都可以被APC吸收，但前者形成的颗粒更容易被APC吸收。抗原和佐剂之间的吸附使抗原在注射部位保持高浓度并缓慢释放，从而延长APC吸收抗原的时间和抗原对免疫系统的影响。
研究发现AH在协助抗原呈递和处理方面优于AP。AP孵育24小时后，抗原呈递和处理下调，此时AH孵育还没有下调。然而，注射含有AP的抗原可以募集单核/巨噬细胞，其在孵育48小时后强烈上调，并且仅AP存在。这表明AH和AP之间存在一些生物学差异，在疫苗配方中应仔细考虑这些佐剂的选择。
NLRP3炎症前信号通路的激活
含铝佐剂可以募集白细胞，促进树突状细胞分化，并加速局部组织炎症，不依赖于Toll样受体。研究表明，含铝佐剂可以靶向核苷酸结合寡聚结构域（NOD），如NLRP3。NLRP3是炎症小体的一个成员，可以识别传递到细胞中的危险信号。巨噬细胞的主要职责是吞噬和处理抗原，含铝佐剂可以通过NLRP3诱导和激活内源性免疫反应，从而促进巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18。
AH和AP都可以通过刺激NLRP3炎症小体来促进IL-1β的分泌，但AH可以刺激THP-1细胞产生比AP更高水平的IL-1β，这可能与这两种含铝佐剂在结构、密度、表面电荷和电荷密度方面的差异有关。
其他免疫刺激机制
研究发现，AH可以激活补体，并诱导肉芽形成和巨噬细胞激活。此外，树突状细胞可以募集铝吸附的抗原抗体复合物，补体因子可以调节B细胞上的受体形成铝吸附的抗原抗体复合物，从而促进免疫反应。因此，含铝佐剂可以激活补体，并通过B细胞和树突状细胞进一步增强免疫反应。
影响铝佐剂疫苗免疫原性的主要因素
吸附强度
抗原吸附的强度是影响免疫反应的主要因素。AP的吸附可以用两个参数来评估：单层的最大吸附量，以吸附容量为特征；以及以吸附系数表征的吸附强度。通常，抗原吸附到铝佐剂上后，其免疫原性增加，但抗原的稳定性随着吸附时间的增加而降低。此外，吸附在固体颗粒表面的蛋白质易于去折叠并失去其二级和三级结构，从而暴露出更多的疏水基团，并进一步增强其与含铝佐剂结合的能力。因此，铝佐剂的吸附强度对抗原-铝复合物的免疫原性、安全性和稳定性有重要影响。
P/Al
P/Al是铝佐剂中磷和铝元素的摩尔比。研究表明，通过用磷酸盐预处理AH以减少羟基的数量，可以改变配体交换吸附的强度，并且免疫反应也可以通过这种方式优化。对于带正电的蛋白质，这些化合物的无定形性质建立了更大的表面积和更高的吸附能力。
PH和离子强度
溶液的pH和离子强度可以显著改变佐剂和吸附产物混合物的沉降悬浮液特性，其可以在絮凝状态和非絮凝状态之间转换。这些颗粒以松散的聚集体形式存在，当它们聚集在一起时具有更高的沉积速率。以这种方式形成的沉积物更松散，通常具有支架状结构，易于再悬浮。到目前为止，对含铝佐剂疫苗混合物的悬浮行为与其免疫原性之间的关系缺乏明确的了解。然而，已经证实，沉淀行为严重影响混合物的分散状态，从而进一步影响疫苗的安全性和稳定性。
颗粒度
控制佐剂悬浮液性能的两个主要因素是颗粒尺寸和分散颗粒的电荷。众所周知，颗粒尺寸会影响悬浮液中的沉降速率，佐剂的颗粒大小是佐剂性质的决定性因素，例如抗原的可用吸附表面积。反过来，这也影响抗原的构象，并可能向免疫个体的免疫系统提供功能表位。
抗原类型和应用剂量
抗原和AP之间有几种结合机制，其中静电吸引和配体交换两种机制在很大程度上决定了疫苗的吸附和洗脱特性。因此，含铝佐剂的疫苗效力也取决于疫苗和制剂中抗原的性质。在制剂前研究中应表征的抗原特性包括：PZC，可接近的磷酸基团或产生磷酸基团的基团的存在，以及溶液的pH对化学和构象稳定性的影响。
下一代铝佐剂
铝佐剂对疫苗接种在控制传染病方面的成功做出了重大贡献。它们在增强对病原体的免疫反应方面是有效的，对病原体的保护依赖于抗体介导的免疫反应。它们价格低廉，安全性良好。然而，在疫苗中使用铝佐剂有一些局限性。如铝佐剂无法支持强大的细胞介导的免疫反应，这是诱导对某些病原体（如结核分枝杆菌）的保护所必需的。因此，下一代铝佐剂主要致力将Th2的响应转换为更多的Th1响应。一种方法是以纳米铝为代表，它的颗粒尺寸比传统的AH更小，同时材料的形状和结晶度也发生了变化。对纳米铝的研究表明，抗体反应更强、更持久，APC对抗原的吸收增加，并从Th2反应转变为Th1/Th17反应。另一种方法是将铝佐剂与其他免疫刺激剂，特别是TLR激动剂相结合。
人类使用的批准疫苗中第一种TLR激动剂和铝佐剂组合是AS04，它包括吸附在铝上的3-O-去乙酰基-4′-单磷酸脂a（MPL），其使用在两种GSK开发的疫苗Cervarix和Fendrix中，分别用于预防人乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒。MPL是脂多糖（LPS）的解毒版本，是TLR4的激动剂。临床前研究表明，AS04极大地增强了抗体的产生，并诱导了高水平的记忆细胞。Fendrix在人类中证实了这些特征，与单独使用铝盐相比，含AS04佐剂的HBV疫苗表现出更高的血清保护率和更持久的抗体反应。
铝-TLR激动剂组合佐剂的第二个例子是AS37，它是一种小分子免疫增强剂（SMIP），TLR7的激动剂，吸附在氢氧化铝上。研究表明，AS37可以在临床前模型中与许多不同类型的候选疫苗一起使用。在包括灵长类动物在内的一系列动物模型中，它可以将免疫反应转换为Th1型，疫苗的免疫原性总体增加。
最后，含铝组合佐剂包括用胞嘧啶/鸟苷寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）加AH，CpG-ODN这是一种已被批准用于人类的TLR9激动剂免疫增强剂。带负电荷的CpG ODNs很容易吸附到AH上。CpG ODNs加AH的联合佐剂已经应用于不同的抗原，包括新冠RBD亚单位和乙型肝炎表面抗原（HbsAg），结果表明联合CpG的铝佐剂疫苗诱导了更强、更平衡的Th1/Th2细胞免疫反应，并且诱导了更高的抗体反应。
小结
近100年来，铝佐剂已被用于数十亿剂疫苗，主要用于儿童和青少年。尽管它们有局限性，例如它们相对不能诱导强大的细胞介导的（Th1）免疫反应和对冷冻的易感性，但它们的安全性和耐受性记录，以及它们的低成本，使这类佐剂继续成为疫苗中非常有吸引力的组分。目前，铝佐剂仍然是评估新的和探索性佐剂的金标准。铝佐剂疫苗的生物物理特性的最新进展，促进了新疫苗配方的开发，并使生产过程中的质量控制成为可能。利用铝佐剂的高吸附能力，它们将越来越多地被用作开发新型组合佐剂的平台，能够驱动对特定病原体的必要免疫反应。这些进展将确保在可预见的未来，铝佐剂仍然是疫苗配方的支柱。
参考文献：
1.Aluminum Adjuvants—‘Back to the Future’. Pharmaceutics. 2023 Jul; 15(7): 1884.
2.Research Progress of Aluminum Phosphate Adjuvants and Their Action Mechanisms. Pharmaceutics.2023 Jun 17;15(6):1756
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