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Introduction
高血压是一种以全身动脉血压升高为特征的临床综合征，已成为心血管疾病（CVDs）的主要危险因素。随着现代社会不健康的生活方式越来越多，高血压患者预计将继续上升。高血压越来越趋向年轻化，这可能会在未来几十年内对人体造成严重的心血管疾病隐患。尽管在高血压的临床治疗和生活方式的改善（包括饮食干预）方面取得了巨大进展，但高血压患者的数量仍在不断增加。
肠道微生物及其代谢产物，包括短链脂肪酸，与高血压的发生密切相关，越来越多的研究表明肠道菌群失调与高血压的发生有关。高血压患者的肠道微生物群不平衡，导致产生短链脂肪酸的细菌数量减少，而短链脂肪酸可以调节代谢和炎症反应，也可以促进血管扩张，从而达到宿主抗高血压的目的。
蛋白质水解物可发挥多种功能活性，如ACE抑制活性、抗氧化、抗炎或抗高血压活性。水解物可以从植物基和动物基蛋白质中提取。越来越多的研究者倾向于使用农业食品工业的副产品作为替代蛋白质来源，因为这些副产品很容易获得，而且相对便宜。
乳清是乳制品加工过程中产生的副产品，它拥有较高的营养价值。可作为蛋白质水解物的优质来源，且可进一步提高乳清的商业价值。研究表明乳清蛋白水解物（WPH）具有良好的生物活性，如抗菌、免疫调节、抗氧化、抗糖尿病和抗高血压的活性。我们以前的研究发现，WPH在体外有很大的ACE抑制活性。然而，其生物活性在经过胃肠道后可能会发生改变。因此，本研究的目的是1）研究WPH在体内的抗高血压作用；2）解释肠道微生物和短链脂肪酸相结合的抗高血压机制；3）通过蛋白质组学研究高血压模型中心脏蛋白质的表达。
图1 主题示意图
Results and Discussion
WPH干预后大鼠基础指标的变化
大鼠的SBP、DBP、心率、身体和器官重量的变化见图2。对照组（Wistar大鼠）的血压明显低于SHR大鼠。卡托普利（阳性对照）干预后，第一周的SBP明显下降。WPH干预后，从第5周开始，SBP和DBP明显下降（2.66 kPa，P＜0.05）。WPH组的心脏系数明显低于模型组，其他器官系数（肝、肾和肺）没有明显变化。WPH的降压作用主要是由于＜3 kDa的组分，我们之前的研究表明这些组分表现出较强的ACE抑制活性。从＜3 kDa的馏分中确定了四种短链肽（QVSTPTL、MPGP、PMHIR、PPLT），并证明其具有潜在的ACE抑制活性。
WPH对血清中ACE、NOS活性和肾素浓度的影响
各组血清中的ACE活性、NOS活性和肾素浓度见图3。WPH干预6周后，SHR血清中ACE活性在WPH-L组（60.02 U/mL）和WPH-H组（57.66 U/mL）明显降低（P＜0.05），且降低程度与阳性组（60.52 U/mL）相当。WPH可能通过抑制体内ACE的活性来达到降压的效果。以前的研究在WPH（Hilmar 8350）中发现了4-8个氨基酸的多肽，并被证明具有抑制ACE的活性。此外，IPAVFK是WPH中确定的多肽之一，被证明是一种ACE抑制性多肽。WPH-H组血清中的NOS活性略有增强（P＞0.05）。5 kDa馏分的WPH能上调内皮NOS基因的表达，并有益于调节人脐静脉内皮细胞的氧化应激。大剂量的WPH干预明显降低肾素浓度（P＜0.05）。WPH可同时抑制ACE活性和降低肾素浓度，达到抑制RAS激活的效果，进而降低SHR的血压。
图3 WPH对大鼠血清中ACE活性（A）、NOS活性（B）、肾素浓度（C）、T-AOC（D）、SOD活性（E）和MDA含量（F）的影响
WPH对氧化应激的影响
血清中T-AOC、SOD活性和MDA含量的变化可用来评估各组的氧化应激水平，结果见图3D-F。与对照组相比，模型组的T-AOC和SOD活性降低，而MDA含量升高（P＜0.05），这表明高血压模型存在一定程度的氧化损伤。在阳性组和WPH-H组中，T-AOC和SOD活性明显增加（P＜0.01），MDA含量大大降低（P＜0.01）。WPH已被证明在体外具有很强的抗氧化性能，特别是小分子量的成分。WPH中0.1～2.8 kDa的馏分比其他馏分表现出更强的自由基清除能力。此外，WPH可以减轻氧化应激损伤，并通过增强SOD活性提高内源性抗氧化防御机制的潜力。
WPH对组织损伤的影响
大鼠心脏和肺部的HE染色结果见图4。如图4A所示，模型组中心肌细胞呈肥大状态。细胞质松散，心肌纤维杂乱无章，局部观察到炎症细胞浸润、心肌细胞变性和坏死。在阳性组，生理形态与对照组相似。在WPH-L组，观察到心肌细胞轻微肥大，细胞质疏松，但心肌纤维保持规则排列。大剂量WPH干预可以进一步缓解坏死和炎症浸润，使心肌细胞的形状更加清晰。定量分析显示大剂量WPH大大降低了心肌细胞的损伤等级（P＜0.05，图4C）。如图4B所示，模型组有局灶性肺泡间隔出血和炎症细胞浸润。这些现象在卡托普利干预后仍然很明显。WPH干预缓解以上症状，在WPH-H组，肺泡形态与对照组相似。肺组织评分表明WPH对肺组织的保护作用优于卡托普利（P＜0.05，图4D）。
WPH对SCFAs和肠道微生物组的影响
大鼠粪便中SCFAs（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸）含量见图5。与模型组相比，WPH组的乙酸、丙酸、丁酸和己酸的含量明显提高（P＜0.05）。WPH-H组的乙酸含量高于阳性对照组（P＜0.05）。WPH干预后肠道微生物的组成变化如图5所示。在门水平上（图5A），WPH干预6周后，Firmicutes的相对丰度下降，而Bacteroides的丰度上升。WPH-H组的Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比例明显降低（P＜0.05）。从科的角度来看，WPH-H组中Lactobacillaceae、Bacteroidaceae和Akkermansiaceae的相对丰度明显上升，而Prevotellaceae的相对丰度明显下降（P＜0.01，图5B）。如图5C所示，WPH组的Lachnospiraceae_NK4A136_group和Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度低于卡托普利组（P＜0.01，图5C）。在WPH干预后，Lactobacillus、Akkermansia和Bacteroides的相对丰度明显增加（P＜0.05，图5C）。乙酸可以下调与血压调节有关的蛋白质编码基因的差异表达，它可以调节与心血管疾病发展和心脏肥大有关的途径。丁酸盐具有抗增殖、抗炎和细胞保护的特性，它在治疗高血压方面有突出的作用。丙酸可以减弱全身T细胞反应和局部心脏免疫细胞浸润，从而导致高血压组织损伤的减弱。乙酸、丙酸和丁酸占SCFAs的很大比例，主要由Bacteroides和Lactobacillus产生。上述结果表明，WPH可能通过提高肠道内SCFAs（尤其是乙酸、丙酸和丁酸）的含量来抑制高血压和组织损伤，而且WPH还有利于具有抑制高血压和产生SCFAs功能的细菌的生长。
图5 WPH对大鼠粪便中SCFAs含量的影响（A）乙酸，（B）丙酸，（C）异丁酸，（D）丁酸，（E）异戊酸，（F）戊酸，和（G）己酸
心脏蛋白质组学分析
火山图显示WPH/模型组、卡托普利/模型组和WPH/卡托普利组的DEP分别为19、25和18个（图7）。GO富集通路结果表明，在WPH/模型组中，BP中的DEPs主要富集在与心肌细胞修复有关的3个GO术语中，包括血管生成（GO：0001525，3个蛋白）、酶联受体蛋白信号通路（GO：0007167，4个蛋白）和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路（GO：0007169，3个蛋白）。KEGG结果表明，WPH/模型组的主要KEGG途径与信号通路有关，包括Wnt信号通路（3个蛋白质）和Apelin信号通路（3个蛋白质）（图6C）。在卡托普利/模型组中，DEP主要参与IL-17信号通路（2个蛋白）和血小板激活（3个蛋白）。Wnt信号通路是一种进化上保守的信号机制，在心脏发生中具有关键功能。它在正常和完全分化的心肌细胞中保持沉默，而它的激活则会导致肥大的心脏。Apelin信号通路是心血管功能的有力调节器，包括血管扩张、血管生成和平衡能量代谢。有理由推测，WPH主要参与调节上述途径，达到对心肌细胞的保护作用，从而减轻心脏重量，但详细机制还需进一步研究。
Conclusion
WPH具有明显的降压能力，并能减轻SHR模型的组织损伤（特别是在心脏和肺部）。WPH干预提高了Lactobacillaceae、Bacteroidaceae和Akkermansiaceae的相对丰度，从而促进了SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸）的产生。蛋白质组学分析表明，WPH可以通过调节心脏中的Wnt信号通路和Apelin信号通路来实现心脏保护和减轻心脏重量的改变。WPH对高血压的改善效果有利于治疗高血压的新型功能食品/药物的开发。
第一作者
窦佩佩，中国农业大学食品科学与营养工程学院在读博士生，主要从事生物活性肽风味改善及功能研究。以第一作者在 LWT-Food Science and Technology，Food & Function，Food Science and Human Wellness上发表文章。
通信作者
谭雨青，副教授，硕导/博导。2013.8—2015.8，美国密西西比州立大学，食品科学与技术专业，理学硕士；2015.8—2018.12，美国密西西比州立大学，食品科学与技术专业，哲学博士。2018.8—2019.6，美国农业部西部地区研究中心，健康加工食品研究组，博士后；2019.11至今，中国农业大学食品科学与营养工程学院，副教授。研究领域及方向：1.水产品加工、副产物高值化综合利用；2.生物活性物质功效评价。主要科研项目：1）国家自然科学基金青年基金（32101863）“草鱼内源丝氨酸蛋白酶对肌原纤维蛋白凝胶的影响及调控机制”，在研，2022/01—2024/12，主持；2）北京市自然科学基金（面上）（6222027）“基于内源丝氨酸蛋白酶介导的鲟鱼肌原纤维蛋白凝胶性能下降的机制研究”，在研，2022/1—2024/12，主持；3）中国科协第七届青年人才托举工程（2021QNRC001），在研，2022/1—2024/12，主持；4）USDA/NIFA项目Enhancing Protein Composition In Soybeans For Improving Tofu Quality Using A3 Subunit As A Marker，参与；5）USDA/NIFA项目Value-Added Food Utilization Of Catfish By-Products And Invasive Carp Meat，参与。学术兼职： Journal of Food Science、LWT-Food Science and Technology、Food Bioscience、Journal of Functional Foods、Journal of Materials Science and Technology期刊审稿人。
Antihypertensive effects of whey protein hydrolysate involve reshaping the gut microbiome in spontaneously hypertension rats
Peipei Doua, Xiaoyi Lia, Xiaoxiao Zoua, Kai Wanga, Lei Yaob, Zhuo Sunb, Hui Honga, Yongkang Luoa, Yuqing Tana,*
a Key Laboratory of Functional Dairy, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China
b Hebei Dongkang Dairy Co., Ltd., Shijiazhuang 052160, China
*Corresponding author.
Abstract
Novel angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides were identified from whey protein hydrolysates (WPH) in vitro in our previous study and the antihypertensive abilities of WPH in vivo were further investigated in the current study. Results indicated that WPH significantly inhibited the development of high blood pressure and tissue injuries caused by hypertension. WPH inhibited ACE activity (20.81%, P < 0.01), and reduced renin concentration (P < 0.05), thereby reducing systolic blood pressure (SBP) (12.63%, P < 0.05) in spontaneously hypertensive rats. The increased Akkermansia, Bacteroides, and Lactobacillus abundance promoted high short chain fatty acid content in feces after WPH intervention. These changes jointly contributed to low blood pressure. The heart weight and cardiomyocyte injuries (hypertrophy and degeneration) were alleviated by WPH. The proteomic results revealed that 19 protein expressions in the heart mainly associated with the wingless/integrated (Wnt) signaling pathway and Apelin signaling pathway were altered after WPH supplementation. Notably, WPH alleviated serum oxidative stress, indicated by the decreased malondialdehyde content (P < 0.01), enhanced total antioxidant capacity (P < 0.01) and superoxide dismutase activity (P < 0.01). The current study suggests that WPH exhibit promising antihypertensive abilities in vivo and could be a potential alternative for antihypertensive dietary supplements.
Reference:
DOU P P, LI X Y, ZOU X X, et al. Antihypertensive effects of whey protein hydrolysate involve reshaping the gut microbiome in spontaneously hypertension rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 1974-1986. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250164.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
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