酚酸主要存在于植物中，是参与植物细胞壁中纤维素、半纤维素和木质素分子键相互交联的重要化合物，包括苯甲酸类衍生物（没食子酸、原儿茶酸）和肉桂酸类衍生物（对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸）。在植物木质纤维素降解过程中，酚酸类成分通过酯酶从其酯化形式中释放出来，游离酚酸对某些病原菌具有毒害作用，是植物抵御病原微生物保护自身的重要途径之一。但部分微生物已经进化出了能够生物转化这些化合物的代谢途径，酚酸脱羧酶（PAD）作为该代谢途径中关键酶之一发挥着重要作用，可以催化酚酸发生非氧化脱羧反应生成相应的4-乙烯基类衍生物。这些4-乙烯基衍生物不仅自身是高档香料，同时也是合成其他香料如香兰素的重要前体物质。目前，市场上的食品香料多为化学合成，不仅需要较多的前体物质，而且反应条件较为剧烈，如微波加热诱导脱羧、高温高压等，给食品工业带来诸多不安全因素。相对而言，生物合成法前体物质单一、条件温和、环境友好，具有广阔的应用前景，而且生物技术制备的香料被视为天然产品。因此，利用PAD生物合成4-乙烯基类衍生物补充这一类型香料的生产途径具有重要意义，有关PAD的来源、分子结构、催化机制及结构和功能的关联、催化特性以及应用等方面的研究也显得十分重要。鉴于此，四川农业大学食品学院的陈阴竹、李琴*、刘书亮*等综述了微生物来源酚酸脱羧酶的研究进展。

0

1

PAD来源

绝大多数PAD来源于微生物，少数来源于植物。目前报道的PAD按作用的底物类型进行划分，可以分为阿魏酸脱羧酶（FAD）、对香豆酸脱羧酶（PDC）和苯基丙烯酸脱羧酶（PAD1）。

FAD首先从荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株UI-670中获得，随后从短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）、索利肠杆菌（Enterobacter soli）、产气肠杆菌（E. aerogenes）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、琉球曲霉菌（Aspergillus luchuensis）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）中均获得了编码PAD的基因片段，经重组表达，证实其具有将阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚的能力。其中肠杆菌属（Enterobacter sp.）的菌株Px6-4表达的FAD具有将阿魏酸作为唯一碳源通过非氧化脱羧作用生产4-乙烯基愈创木酚的特性，故常被作为研究FAD结构、催化机理和酶学性质的有力工具。此外，C. guilliermondii中含有内源因子，可促进阿魏酸脱羧。经序列比对，发现在蜡状芽孢杆菌（B. cereus）和管状曲霉（A. tubingensis）等菌株中也存在编码FAD的基因片段。

Cavin等首次从植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LpCHL2中发现PDC。随后从枯草芽孢杆菌（B. subtilis）中获得PDC，其氨基酸序列与植物乳杆菌PDC和短小芽孢杆菌FAD分别具有71%和84%的同源性。从戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）中克隆、重组表达的PAD对对香豆酸具有催化活性，与植物乳杆菌PDC具有81.5%的同源性。此外，乳酸菌、小蛇苔（Conocephalum japonicum）、萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus）和短小芽孢杆菌BP-7中也发现了PDC的基因片段，可以将对香豆酸转化为相应的4-乙烯基酚类物质。其中，C. japonicum CjPAD是首次从植物中表征的PAD，可催化对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸生成相应的乙烯基物质，极大地丰富了该酶的来源，为该酶的研究提供了新方向。

在S. cerevisiae和黑曲霉（A. niger）中鉴定出编码可分解肉桂酸的PAD1基因，但酿酒酵母PAD1活力明显低于细菌来源PAD。研究发现，酵母菌对苯丙烯酸（肉桂酸）和阿魏酸进行脱羧需要PAD1和FAD两种酶同时存在。

PAD来源及底物特异性和动力学参数如表1所示。

0

2

PAD的分子结构

近年来，已有学者对不同生物体的PAD晶体结构进行了报道。学者首先解析了两种野生型酶的晶体结构，即L. plantarum LpPDC（PDB代码：2GC9）和B. subtilis BsPAD（PDB代码：2P8G）。随后，Rodríguez等获得了野生型LpPDC的另一种结构（PDB代码：2W2A）以及LpPDC 3 种突变体（Tyr20Phe、Glu71Ser和Arg48Gln）的结构。

此外，还确定了BsPAD突变体（Tyr19Ala、Enterobacter sp. Px6-4的EcFAD、B. pumilus FDC、S. cerevisiae FDC1和I. farinosa IfPAD结构。通过分析PAD的结构，可以发现PAD家族所有成员的结构具有较高的相似性，为理解其脱羧机理提供了理论基础。将BsPAD、LpPDC和EcFAD的结构叠加得到图1，可发现3 种酶具有高度的结构相似性，结构之间的差异主要存在于蛋白质的N端和C端的无规线圈中。

PAD（裂合酶类EC 4.1.1.102）属于同型二聚体，其由两个单体组成，每个单体对应一个底物结合位点，如图2所示。两个相同的亚基底物结合腔入口空间朝向相反，底物催化反应彼此独立，酶学性质表现为互不干扰。其中，二聚体结构的维持主要依靠β2的残基之间的相互作用。以肠杆菌EcFAD单体结构为例，PAD亚基结构可分为3 个部分：β-核心桶、螺旋底部和C-/N-端延伸，如图3所示。PAD结构由两个相互扭曲且正交排列的β折叠片构成，每个β折叠片由4 条反向平行的β折叠链构成，其中β9以氢键结合到两个折叠片上，它们共同形成一个开口的圆管，在PAD家族中β桶核心结构高度保守。螺旋底部位于核心β桶底部，在不同类别和来源的PAD结构中，该部分有所不同，其中Enterobacter sp. Px6-4 EcFAD的螺旋底部由α1、α2、η1和η2组成；而L. plantarum LpPDC的螺旋底部由α2、α3和α4组成；B. pumilus PAD的螺旋底部仅含一条α2。底物结合位点位于β桶核心和螺旋底部之间，由β8、β9折叠片以及β1/2、β3/4发卡组成，以两种不同的构象存在：封闭状态，避免底物进入活性位点；开放状态，底物的存在触发构象变化，允许底物进入活性位点。研究发现，活性口袋内的氨基酸与酶构象具有较大的关联，关键位点的氨基酸有所不同，酶的构象也会随之改变。此外，对EcFAD和LpPDC的活性口袋进行比较可以发现，两种酶的活性口袋内的氨基酸残基有差异，当没有底物诱导时，EcFAD处于封闭状态，而LpPDC则处于开放构象。PAD的C-端及N-端变异率较高，研究认为PAD的C-端及N-端结构与PAD的底物特异性具有密切联系。

0

3

PAD的催化机制及结构和功能的关联

目前对PAD脱羧机理的报道仍较少，研究认为PAD脱羧是一个涉及醌中间体的机制，而不是1,2-加成途径，即通过底物双键的质子化形成醌中间体，随后在醌中间体引起的电子流作用下使C—C键裂解生成相应的4-乙烯基物质和CO 2 ，其催化过程如图4所示。第1步，在谷氨酸羧基阴离子的作用下，底物的酚羟基被去质子化；第2步，电子流过底物，并在底物羧基的邻位碳原子上形成亲核中心；第3步，利用天冬酰胺（Asn）的酰胺基团与水形成氢键以确保疏水口袋中存在水分子，水分子作为质子供体提供质子，作为亲核中心的碳原子接受质子形成醌类中间体；第4步，酪氨酸侧链的羟基与释放的羧基相互作用，使其保持在固定的位置上，这有助于电子传递的特异性；此时，醌类中间体促使羧酸盐发生第2次电子传递；最后，供电子基团使共价键异裂，产生4-乙烯基酚类物质并释放出CO 2 。

Parada-Fabián和Kumar等通过分子动力学计算和分子对接研究了PAD对底物的亲和力，认为在进入活性位点前不同电荷的残基变化可能会影响底物在腔内的取向直至底物定位到活性位点。Asn23、Tyr27、Glu134对FAD催化过程起着重要作用，Asn23通过其酰胺基获得极性，可以与水分子形成氢键，确保在疏水口袋中存在水分子，Tyr27和Glu134通过氢键分别连接底物的羧基和羟基，突变分析证明了这些残基的重要性。研究人员利用B. subtilis BsPAD和L. plantarum LpPDC晶体结构研究酶对对香豆酸的脱羧过程，对其中的关键氨基酸残基进行了分析，发现与底物羧酸基相互作用的均为酪氨酸，其中BsPAD中为Tyr11和Tyr13，LpPDC中为Tyr18和Tyr20；与苯酚部分形成氢键的分别为精氨酸（Arg，R）41和Arg48；Glu64、Glu71是接受对羟基质子的一般碱基，当将这几个位点的氨基酸突变为其他氨基酸时，酶活力大大降低甚至消失。图5展示了BsPAD和LpPDC活性中心的关键残基与底物相应基团的作用。Max等研究指出，S. cerevisiae FDC1的133位丝氨酸残基对其催化活性至关重要，当其丢失会导致酶活性完全丧失。

据研究，PAD的C末端区域与酶活性，特别是底物特异性有关。经PAD氨基酸序列比对发现中间部分高度保守，但在C端及N端有很大的差异，导致其底物特异性有所不同。LI Qin等通过替换C-末端构建了突变体，研究发现C端延长得到的突变体使对香豆酸、阿魏酸和芥子酸的K m 明显减小，V max 、K cat /K m 均增大，也印证了C端会对底物特异性有影响。大部分PAD能对阿魏酸和对香豆酸脱羧，即催化含有对羟基不饱和侧链和用—OH、—H、—OCH 3 取代不饱和侧链的酚酸。对不同来源的PAD基因序列和底物特异性进行比较发现，芽孢杆菌属的PAD可以催化更多的底物，研究还发现，芽孢杆菌属PAD的C端比其他菌属的C端少几个氨基酸。枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的PAD均能催化阿魏酸、对香豆酸及咖啡酸，且对相应底物的相对酶活性影响基本一致。B. amyloliquefaciens产生的PAD和B. licheniformis BLPAD比先前报道的PAD具有更广泛的底物特异性，除了脱羧阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸外，该酶还能够使芥子酸脱羧，但是两种菌种产生的PAD对不同底物的酶活性有所差异，对其氨基酸序列进行比对后发现，其同源性达到了80%以上，主要差别存在于C端。L. brevis RM84 PAD、L. plantarum CECT 748 T 和L. plantarum LpCHL2利用的酚酸种类一致，但对不同底物的酶活性不同，发现其氨基酸序列有85%～90%的同源性，对比后发现差异主要存在于C末端区域。与微生物来源的PAD相比，植物的PAD具有更高的K m 和更低的V max ，意味着其对相应底物的亲和力弱，催化能力弱。

0

4

PAD的催化特性

目前全世界发现的酶类约有3 000多种，但真正工业化大规模生产的仅有20余种，这主要与酶会受到反应条件（如高温、强酸、强碱、有机溶剂等）和底物产物浓度的影响有关。通过催化特性的研究，找到一个耐受性好、性质稳定的PAD，并采取一定措施提高其能力，可以为PAD的工业化应用提供重要的理论基础。不同物种来源的PAD，最适的催化反应条件存在着较大差异。如表2所示，PAD更适于在酸性条件下反应，大部分在pH 5～6范围内获得最佳酶活性。但B. amyloliquefaciens Q-426的BaPAD-Q-426最适pH值达到了8.0，当pH值为7.0～8.0时，酶活力保持稳定。P. fluorescens的FAD最适pH值为7.3。在pH值为4.0条件下，Enterobacter sp. Px6-4的EcFAD获得最佳酶活性。就pH值稳定性而言，无论是细菌还是真菌PAD，当放置在pH值小于4或大于9条件下酶均会迅速失活。其中，B. atrophaeus BaPAD、B. licheniformis BLPAD、Enterobacter sp. Px6-4 EcFAD、B. bruxellensis PDC和A. luchuensis AlPAD在较广的pH值范围内表现出良好的稳定性，该性质有利于应用在工业生产中。

不同物种对环境的适应机制不同，导致同一种酶的反应环境也存在较大差异。芽孢杆菌属PAD最适反应温度均在37 ℃及以上，其中，来源于B. amyloliquefaciens ZJH-01的PAD（P-WT）最适温度达到了55 ℃。此外B. atrophaeus BaPAD和B. subtilis BsPAD最适反应温度也达到了50 ℃。乳杆菌PAD最适温度在20～30 ℃范围内，当温度超过37 ℃酶活性会显著降低。不同真菌产生的PAD最适反应温度差别较大。B. bruxellensis PDC、B. anomalus PAD1和A. luchuensis AlPAD最适反应温度均为40 ℃。而C. guilliermondii CgPAD在25 ℃条件下获得最佳酶活性。I. farinosa IfPAD最适反应温度为19 ℃。应用到工业生产中的酶还需要满足具有在较广的温度范围内稳定这一性质。就其耐热性而言，芽孢杆菌属的PAD耐热性较高，可在较高温度条件下保温一定时间，并保持相当程度的酶活力。与PAD家族的其他成员相比，Enterobacter sp. Px6-4的EcFAD耐热性最强，在较广的温度范围内表现出稳定性，当温度升高到70 ℃仍保留一定酶活性。乳杆菌属的PAD耐热性均较低，当温度达到37 ℃时，酶活性急剧下降。真菌中的A. luchuensis AlPAD耐热性也较强，50 ℃保温60 min能够保持100%的酶活性。

相较于细菌中的PAD，真菌的稳定性较强，但真菌PAD催化活性较低，且在催化过程中需要一定的辅助因子，从而限制了真菌PAD在食品工业上的应用。例如，S. cerevisiae PAD1催化过程中需要辅助因子黄素单核苷酸的存在，且催化活性较低。C. guilliermondii CgPAD的催化反应也需要相应的辅助因子，即硫醇类物质的存在。

0

5

提高酶催化效率的技术

5.1 酶分子改造技术

近年来，随着基因工程技术和分子克隆技术的不断发展，对PAD进行分子改造以获得稳定性好以及高产的基因工程菌成为了该领域的研究热点。对PAD稳定性和耐高温特性的研究对扩宽该酶的应用领域具有重要作用，有研究表明，N末端的延伸可能会增加酶结构的稳定性和耐热性，但关于这部分的研究仍比较少。Gu Wen等将Enterobacter sp. Px6-4 EcFAD与L. plantarum LpPDC的结构进行比对后发现，EcFAD底物结合袋更大，可以接受更多的底物，这可能与N末端的延长有关。将C. japonicum CjPAD的N端截断，可发现酶活性完全丧失，说明N端与酶的特性具有重要作用。LI Qin等对B. amyloliquefaciens P-WT的N端进行延伸得到P-N突变体，比较其耐热性和pH值稳定性，发现P-N突变体在碱性环境中具有较高的酶活性（在pH 5.0和9.0条件下放置30 min后残余酶活性分别为64%和44%）；N端延伸也有助于热稳定性的提高，未经过N端延伸的酶在50 ℃条件下放置60 min后活性下降甚至消失，而P-N突变体在50 ℃和60 ℃条件下保温60 min后，其残余酶活力分别为95%和4.8%。

5.2 酶固定化技术

固定化酶技术指的是将游离酶通过某些方法限定在一定的空间或完全附着在一定的载体上，使之不能自由移动，但是仍能保持酶的空间结构和活性中心完整性的技术。利用酶法生产4-乙烯基酚类物质的过程中产生的副产物较少，反应条件简单温和。但游离生物酶在反应体系中存在稳定性差、易失活、不溶于有机溶剂、不可重复利用等问题，通过固定化可以在一定程度上克服上述不足，保持其催化活性。Ni Wenjuan等为提高B. atrophaeus BaPAD的催化效率，选择ZSM-5沸石分子筛、介孔Y分子筛、二氧化硅和NaY分子筛对PAD进行固定化，其中介孔Y分子筛固定化作用最好；此外，经过固定化的酶热稳定性提高，在4 个循环后残余酶活力在50%以上，转化率也从35%提高到55%。利用NaY分子筛固定B. atrophaeus BaPAD，经过固定化的酶稳定性和可逆性较高，在单双向反应体系中重复利用10 次仍可以保持73%初始活性，使底物在大规模水平上持续地转化为相应产物。赵婷等比对多种固定化材料，如壳聚糖、磁性壳聚糖、海藻酸钠和两种大孔树脂的固定效果，并对工艺参数进行优化，结果显示壳聚糖为最优的固定化材料且经过优化的PAD固定化效果良好，达到93%。采用Ni-NTA作为固定化材料，对地衣芽孢杆菌PAD进行固定化，可以使固定化酶在多次使用后仍能保持较高活性，该固定化酶在重复利用5 次后剩余酶活力仍能达到90%以上。通过PAD全酶水凝胶催化对香豆酸，高效转化为对羟基苯乙烯，长时间的使用后仍能保持98%以上的转化率，同时，该方法通过交联实现三维结构的固定化，可以避免将酶固定在反应器壁的平面而限制催化性能等问题。PAD经过固定化后，酶的稳定性以及回收率得以提高，从而降低了成本，使实现其工业化生产成为可能。

5.3 双向反应体系

在之前的报道中提到，高浓度的底物和产物会对微生物或酶产生毒性，导致产物4-乙烯基衍生物的合成率显著降低。此外，底物和产物在水中的溶解度较低。利用双相反应体系可以较好地解决这些问题，该体系由两种互不相溶的液体组成，底物和产物溶解在有机相中，而酶溶解在水相中。在该体系中，通过搅拌使适量浓度的底物进入水相与酶发生反应，生成的产物随之进入有机相，从而保证反应的持续进行。关于在两相转化体系中利用野生型细胞或克隆表达得到的PAD重组菌株生产4-乙烯基衍生物已有部分报道。胡宏飞通过单相与双相转化体系比对实验后发现，双相反应体系转化率明显高于单相体系，当底物浓度达到100 mmol/L时，单相反应体系转化率仅为40%；而双相反应体系可在400 mmol/L底物浓度时达到97%的转化率。将含有B. amyloliquefaciens PAD基因的重组质粒转入大肠杆菌，利用重组大肠杆菌降解对香豆酸生产4-乙烯基苯酚（4-VP），发现由于产物毒性，重组大肠杆菌对底物的转化率仅为22.7%，而选择1-辛醇构建双相反应体系后，转化率提高到98.0%，大大提高了产率。将含对PDC基因片段的质粒转入到恶臭假单胞菌（P. putida），利用重组菌株分解对香豆酸得到4.5 mmol/L 4-VP，产率仅为6.7%，应用两相体系（水-癸醇）后得到21 mmol/L 4-VP，产率提高了近5 倍。将对PDC重组大肠杆菌作为生物催化剂制备4-VP，利用甲苯作为有机相构建双相反应体系可以提高酶活性并有效提取4-VP，发现与之前相比4-VP产率提高了3 倍，由28%提高到96%。构建成功的FAD重组质粒转入大肠杆菌，利用该菌株在双相反应体系（水-辛烷）中反应，4-乙烯基愈创木酚（4-VG）产量得以提升，从每25 g阿魏酸生成2.4 g 4-VG提高到生成13.8 g 4-VG。双相反应体系的研究对将PAD应用于实际生产具有重要的理论指导意义。

0

6

结 语

随着消费者对天然产品的需求越来越迫切，天然食品香料呈现快速发展趋势，因此探寻安全高效的天然4-乙烯基酚类物质的合成途径很有必要。目前，市场上的食品香料4-乙烯基酚类物质多为化学合成，存在原料成本高、工艺复杂、环境污染等不足。相对而言，从天然酚酸类物质中利用PAD生物合成4-乙烯基酚类物质属于天然物质，且具有反应温和、纯度高、转化率高等优点，发展潜力巨大。现阶段，对微生物或植物来源PAD的异源表达、结构及相关特性已有较多报道，但丰富PAD的资源，实现其异源高效表达，筛选适合实际生产应用的PAD；完善PAD的催化机制；阐明PAD的底物特异性分子调控机制等这些方面仍是PAD的重要研究内容。

本文《微生物来源酚酸脱羧酶的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷11期323-332页. 作者：陈阴竹，覃池，李琴，胡凯弟，李建龙，刘书亮. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230517-163. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为加强企业主导的产学研深度融合，促进食品科研成果转化和服务地方经济产业，由全国糖酒会主办，北京食品科学研究院、中国食品杂志社和中粮会展（北京）有限公司承办的“食品科技成果交流会”将于2024年10月29-31日糖酒会期间在深圳国际会展中心举办，以当前食品科技发展趋势和食品产业发展的重点科技需求为导向，针对食品产业发展面临的重大科技问题，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）