核桃是一种广泛分布在世界各地的坚果，在全球范围内被商业化种植，其主要成分包括脂肪和蛋白质。在压榨核桃油的过程中，会产生大量的核桃粕，其中富含各种蛋白质。与核桃蛋白相比，核桃肽具有更好的溶解性、吸湿性、乳化性和胃肠消化的稳定性等优良特性。此外，核桃多肽具有多种生物功能，在抗氧化、降血脂、抗肿瘤、改善记忆和降低患阿尔茨海默症风险以及改善肠道菌群等方面具有显著的效果。
基于此，北京工商大学食品与健康学院的张子 杰、田益玲、马 爱进*等人以核桃粕作为原料，通过复合酶酶解的方法制备核桃多肽，对其进行抗氧化性分析、结构表征，并通过细胞实验探索核桃多肽对氧化损伤HepG2细胞的保护作用。以期为核桃高值化利用提供理论依据。
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核桃蛋白水解产物的抗氧化活性
如图1a所示，核桃蛋白水解产物的羟自由基清除率与0～30 mg/mL的质量浓度呈剂量依赖性，半抑制浓度（IC50）值为13.20 mg/mL。这表明此蛋白水解产物浓度对羟自由基具有明显的抑制作用。如图1b所示，核桃蛋白水解产物对DPPH自由基的清除率在0～200 μg/mL范围内呈剂量依赖性，IC50值为36.07 μg/mL。结果表明，核桃蛋白水解产物具有清除DPPH自由基的能力。如图1c所示，在0～150 μg/mL范围内，底物质量浓度与ABTS阳离子自由基清除率之间存在显著的剂量依赖关系。在底物质量浓度为100 μg/mL时，水解产物的ABTS阳离子自由基清除率为90.13%，IC50值为52.02 μg/mL。核桃蛋白的酶解可能导致肽的空间构象、氨基酸组成和分子排列的变化，从而提高清除ABTS阳离子自由基的能力。
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核桃多肽不同分子质量组分抗氧化活性
将超滤后得到不同分子质量的核桃多肽进行ABTS阳离子自由基清除能力比较，结果如图2所示。随着核桃多肽分子质量的逐渐减小，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率呈现逐渐增大的趋势。其中分子质量＜1 kDa抗氧化肽组分的ABTS阳离子自由基清除率最高，为90.95%。结果表明，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率与肽分子质量呈负相关。
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核桃多肽＜1 kDa组分抗氧化活性
由图3a可知，＜1 kDa组分对羟自由基有较好的清除作用，在0～30 mg/mL范围内，核桃多肽组分的羟自由基清除率随质量浓度增大而增大，IC50值为11.47 mg/mL。核桃肽的特点是分子质量小，含有丰富的供氢体，可以通过提供氢质子有效减少高度氧化的自由基。如图3b所示，在底物质量浓度0～600 μg/mL范围内，核桃多肽的DPPH自由基清除率随底物质量浓度增大而逐渐增大，IC50值为35.67 μg/mL。这可能归因于核桃蛋白被酶解后释放作为质子供体的特定物质，这些质子供体与DPPH自由基发生反应，将其转化为稳定的反磁性分子，从而显示出强大的抗氧化活性。如图3c所示，在0～150 μg/mL范围内，核桃多肽的ABTS阳离子自由基清除率随底物质量浓度增大而增大，随后趋于稳定，在100 μg/mL时，其ABTS自由基清除率为90.45%，IC50值为49.72 μg/mL。核桃多肽表现出强大的清除ABTS阳离子自由基能力。尽管核桃多肽的抗氧化能力比VC弱，但这种天然的功能性活性物质可以安全地长期食用，并且没有表现出毒副作用。
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核桃多肽＜1 kDa组分的结构表征
4.1 微观结构观察
由图4可看出，核桃多肽形状不规则、表面光滑、结构致密，有大量粗糙纹路和孔隙，这种结构能够极大地增加核桃多肽的表面积。这可能是由于核桃蛋白质结构因蛋白酶酶解而被破坏，使得疏水性基团暴露在多肽表面，进而提高核桃多肽疏水性，提升抗氧化活性。分子质量、疏水性、氨基酸组成和肽序列被认为是影响肽抗氧化活性的关键结构特征。有研究人员对具有抗氧化活性的植物来源肽与其疏水性作用的关系进行了综述，得出疏水性作用是多肽抗氧化活性的决定因素之一。
4.2 紫外全波长扫描分析
如图5所示，核桃多肽的最大吸收峰位于225 nm波长处，表明该波长范围产生价电子跃迁，最大吸收峰的吸光度为8.94。这可能是因为＜1 kDa核桃多肽在酶解过程中部分肽链被水解，使游离氨基酸含量提高以及多肽中生色团和助色团的偏光性而形成。
4.3 荧光光谱扫描
有研究表明色氨酸（Trp）残基与最大发射波长（λmax）有关，如图6所示，核桃多肽的λmax分布在345 nm处，当λmax＞330 nm时，这说明核桃多肽中的Trp残基主要暴露在多肽分子表面的极性环境中。同时，荧光强度与暴露在极性环境中Trp残基的数量呈正相关。Trp残基暴露在极性环境中的程度和数量能够反映核桃多肽的表面疏水性，这可能是核桃多肽具备抗氧化活性的原因之一。有研究表明，Trp、脯氨酸等疏水氨基酸在消除自由基中起着重要作用。
4.4 圆二色光谱分析
圆二色光谱可以表征核桃多肽的二级结构，结果如图7、表1所示。核桃多肽的二级结构包含多种构象，主要为β-折叠（相对含量为36.6%）和无规卷曲（相对含量为36.5%），其中反平行式β-折叠相对含量为33.7%，平行式β-折叠为2.9%。β-折叠及无规卷曲含量较高，α-螺旋结构（紧密的稳定结构）含量较低，这能够反映出多肽表面的疏水性增强。核桃多肽表现出一定的抗氧化能力，原因可能是蛋白质结构由于酶解而发生改变，肽键被蛋白酶切断，使其空间结构打开，这种结构变化意味着蛋白质分子内无序结构（β-折叠和无规卷曲）的含量变高，从而使疏水性位点暴露在多肽分子外部的极性环境中。疏水性对多肽的抗氧化活性具有重要影响。当疏水性氨基酸残基暴露在多肽表面时，其有助于多肽在脂质-水界面处溶解，进而更有效地清除自由基，发挥抗氧化作用。
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＜1 kDa核桃多肽组分及H2O2对HepG2细胞存活率的影响
为了确定后续实验中核桃多肽组分的作用浓度，通过CCK-8实验研究了不同浓度的核桃多肽组分对HepG2细胞存活率的影响，结果见图8a。与空白组相比，＜1 kDa核桃多肽组分的质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL时，对细胞存活率无影响。因此，选取0.4、0.6、0.8 mg/mL的＜1 kDa核桃多肽组分进行下一步实验。
ROS的主要成分之一是H2O2，能够诱发氧化应激，破坏细胞的氧化还原平衡，在氧化应激条件下最终导致细胞程序性死亡或组织损伤。如图8b所示，经过不同浓度H2O2孵育4 h后，随着H2O2浓度的增加，细胞存活率持续降低，并呈现一定的浓度依赖性。当H2O2浓度为1 000 μmol/L时，细胞存活率仅为47.28%。经过计算，细胞的IC50为804.9 μmol/L，因而选择800 μmol/L作为后续实验的H2O2浓度。
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＜1 kDa核桃多肽组分对氧化损伤HepG2细胞存活率及ROS的影响
如图9a所示，与对照组相比，模型组的细胞存活率显著降低（ P ＜0.05），从而证实了实验模型成功建立。用不同质量浓度的核桃多肽样品培育24 h后，其细胞存活率呈浓度依赖性增加趋势，这表明核桃多肽可以减轻H2O2诱导的细胞损伤，并保护细胞存活。当核桃多肽质量浓度为0.8 mg/mL时，可以显著提高HepG2细胞的存活率（ P ＜0.05）。
ROS的过度产生可能破坏细胞氧化还原系统的平衡，导致组织损伤。因此，本实验通过测定细胞内的ROS水平评估细胞内氧化损伤程度。如图9b所示，与对照组相比，模型组的ROS水平度显著增加（ P ＜0.05），表明实验模型有效建立。与模型组相比，0.8 mg/mL核桃多肽组的ROS水平显著减少（ P ＜0.05），为107.81。这与Liu Chunlei等的研究结果一致，核桃多肽能够提高细胞存活率，减少细胞中ROS的生成。
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＜1 kDa核桃多肽组分对H2O2诱导HepG2细胞内抗氧化酶的影响
如图10a所示，模型组的SOD活性显著降低。然而，当用不同质量浓度的＜1 kDa核桃肽组分预处理HepG2细胞时，SOD活性呈明显的剂量依赖性增加，当质量浓度为0.8 mg/mL时，SOD活力为172.20 U/mg。由此表明，＜1 kDa核桃多肽组分能够提高HepG2细胞中SOD的活力水平，表明其具有增强细胞抗氧化活性的潜力。如图10b所示，与对照组相比，模型组的CAT活力下降；与模型组相比，样品组的CAT活力均提高，并随着多肽组分浓度的增加而增加。由此表明，＜1 kDa核桃多肽组分能够提高HepG2细胞中CAT的活力水平。GSH-Px的主要功能是清除过氧化氢和脂类氢过氧化物，从而保持细胞的稳态。如图10c所示，与空白组相比，模型组的GSH-Px的活力水平显著下降；与模型组相比，经＜1 kDa核桃多肽组分预处理样品组的GSH-Px的活力水平均提高，并随着多肽组分浓度提高而提高。氧化型谷胱甘肽能够被GSHRx还原成GSH，提供清除ROS所需的还原力，从而保护生物系统免受氧化损伤。如图10d所示，模型组的GSHRx的活力显著下降；与模型组相比，样品组的GSH-Rx活力水平均提高，并随着多肽组分浓度提高而提高。
结 论
本实验以核桃肽为研究对象，分析了超滤后不同分子质量核桃肽的抗氧化活性，发现分子质量＜1 kDa核桃多肽组分的抗氧化活性最强，其羟自由基清除能力的IC50值为11.47 mg/mL、DPPH自由基清除能力的IC 50 值为35.67 μg/mL、ABTS阳离子自由基清除能力的IC50值为49.72 μg/mL，均呈现出浓度依赖性。同时，＜1 kDa核桃多肽组分对H2O2引起的HepG2细胞氧化损伤具有一定的保护作用，能够减少HepG2细胞内ROS含量，提高HepG2细胞内抗氧化酶的活力水平。核桃多肽形状不规则、表面光滑、结构致密，有大量粗糙纹路和孔隙。核桃多肽的二级结构以多种构象并存，主要为β-折叠（相对含量为36.6%）和无规卷曲（相对含量为36.5%）。核桃多肽具有良好的抗氧化活性，可用于开发核桃肽功能食品，本研究对实现核桃粕的高值化利用有一定参考价值。
本文《核桃多肽结构表征及抗氧化活性》来源于《食品科学》2024年45卷7期，作者：张子杰，田益玲，夏君霞，马爱进。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230531-284。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：小娴；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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