FSHW | 利用定量蛋白质组学分析不同冷却速率下猪肉品质|丙酮酸|果糖|猪肉|细胞|蛋白质|蛋白酶

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Introduction

肉的品质，尤其是嫩度，是影响消费者购买意愿的关键指标。影响肉类品质的因素很多，其中冷却作为生肉加工的必经工序，是保证肉类品质的关键环节。冷却通常通过降低微生物生长和化学和酶促反应的速率来保持优异的肉质。屠宰后不适当的冷却方法会导致肌节收缩，降低参与骨骼蛋白降解的蛋白酶的活性，对肉质造成不可逆的损害。传统的肉类冷冻方法存在着冷藏时间过长、难以保持僵直前的肉品质等问题。超快速冷却（VFC）是一种在屠宰后短时间内将肉的中心温度迅速降至-1 ℃的冷却方法，具有加速肉类降温、减少冷损的特点，在鲜肉的保存和运输中具有优势。VFC延缓了屠宰后的生理生化过程，有效地减少了肉表面微生物的增殖，使肉的高品质得以保持。

VFC后肉中肌原纤维小片化指数和肌节长度增加，剪切力减小。在15.10 ℃/h的降温速度下，VFC通过激活μ-calpain和促进肌动球蛋白解离改善嫩度。为了充分阐明VFC对肉质的调控作用，有必要在分子水平上探索VFC所涉及的蛋白质种类、数量以及代谢途径的变化，以便更好地在工业上应用，并开发出适合不同情况的参数。

中国农业科学院农产品加工研究所的侯成立副研究员和张德权研究员等在本文以不同降温速度处理的肉为样本，利用数据独立获取（DIA）技术对不同降温速度肉中的差异蛋白质进行定量分析，从而更全面地解释降温处理对肉类品质的调控机制。

Results and Discussion

超快速冷却处理后生鲜肉的剪切力在贮藏期间均未出现显著升高，对照组猪背最长肌剪切力先升高后降低在宰后24 h达到最大僵直期，宰后120 h解僵完全。降温速度为14.43 ℃/h的背最长肌不发生冷收缩与宰后僵直，且肉品嫩度得到改善。对照生鲜肉肌原纤维直径、肌节长度均一有序，肌节中的I带、A带、H区范围宽，Z线与M线保持较完好，清晰存在。随后H区和I带变得模糊，Z线发生明显降解。当肌原纤维中的ATP耗尽时，宰后僵直和伴随而来的肌节收缩开始发生。随着宰后时间的延长，肉中的肌节长度逐渐增加，这可能是肌动球蛋白解离和肌原纤维蛋白降解共同作用的结果。超快速冷却处理后，生鲜肉肌原纤维的M线、H区和I带在宰后消失，有相当比例的纤维处于挛缩的状态。生鲜肉肌节长度显著降低，可能与低温刺激有关。将僵硬前的肉暴露在接近冰点的温度下会导致肌节收缩的发生。低温刺激（0 ℃）会降低肌质网的钙蓄积能力。大量的钙离子被释放到肌浆中激活ATP酶，从而引起肌节收缩。

超快速冷却处理后，有46种上调蛋白质和33种下调蛋白质。上调的蛋白质包括蛋白酶体亚基β、酰基辅酶A脱氢酶家族成员8、F-肌动蛋白α亚基、热休克蛋白β2、肌LMNA相互作用蛋、蛋白酶体亚基β-4、肌球蛋白7、四个半LIM结构域蛋白1、26S蛋白酶体调节亚基8、L-蛋氨酸硫氧化物还原酶、3-羟基丁酸脱氢酶2等，主要参与氧化还原过程、蛋白降解过程等。下调的蛋白质包括果糖二磷酸醛缩酶、线粒体乙醛脱氢酶2、IF杆结构域蛋白、丙酮酸激酶、锌肌动蛋白结合重复蛋白2、小肌肉蛋白、伴肌动蛋白、肌原调节蛋白2等，主要参与一些代谢过程以及构成细胞骨架。KEGG功能分类的前5位主要包括：代谢途径、碳代谢、氨基酸的生物合成、丙酮酸代谢、蛋白酶体。参与以上途径的差异蛋白包括参与糖酵解途径的酶ALDOA、PKM，参与氧化还原途径的酶BDH2、ACAD8，参与蛋白降解的蛋白酶体PSMB4、PSMB6、PSMC5等。说明超快速冷却处理下调了糖酵解酶果糖二磷酸醛缩酶与糖酵解限速酶丙酮酸激酶的表达量，延缓了糖酵解进程。蛋白酶体与VCL之间相互作用密切。VCL作为参与构成肌纤维骨架结构的关键蛋白，属于肌纤维骨架结构向肌肉传递力量的蛋白质链。蛋白酶体可能通过调控VCL的降解，进而促进参与形成细胞骨架的结构蛋白及FHL1的降解，最终改善肉品嫩度。

超快速冷却处理下调了糖酵解酶果糖二磷酸醛缩酶与糖酵解限速酶丙酮酸激酶的表达量，延缓了糖酵解进程；超快速冷却提高了m-钙蛋白酶与蛋白酶体（PSMB4、PSMB6、PSMC5）的表达量，导致参与构成细胞骨架的蛋白发生降解，进而促进肉品嫩化。

Conclusion

生鲜肉经14.43 °C/h降温处理后，没有出现僵直和冷收缩现象，嫩度明显改善。不同降温速度处理后的肉中共有79种差异蛋白，主要参与碳代谢、丙酮酸代谢和蛋白酶体途径。超快速冷却处理通过下调果糖二磷酸醛缩酶、丙酮酸激酶等代谢酶的表达，延缓了屠宰后细胞代谢和糖酵解的生理生化过程。超快速冷却通过上调蛋白酶体和钙蛋白酶的表达，促进构成细胞骨架的蛋白质的降解。超快速冷却保持了肌节的完整性，同时改善了肉的嫩度。这些新发现有助于我们理解冷却速率调节嫩度的潜在机制。

DIA-based quantitative proteomic analysis on porcine meat quality at different chilling rates

Yuqiang Bai1, Tongjing Yan1, Fei Fang, Xin Li, Su Wang, Juan Li, Chengli Hou*, Dequan Zhang*

Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety Control in Storage and Transport Process, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

The objective of this study was to evaluate the effects of chilling rate on porcine meat quality from the perspective of proteome using data independent acquisition (DIA)-based quantitative proteomic strategy. M. longissimus thoracis et lumborum (n = 9) was assigned randomly to the control group (3.72 ℃/h), very fast chilling-Ⅰ group (VFC-Ⅰ, 9.31 ℃/h) and VFC-Ⅱ group (14.43 ℃/h). The DIA was used to analyze the difference in proteins under different chilling rates. Results showed that tenderness was improved significantly in meat at the chilling rate of 14.43 ℃/h. Seventy-nine differential abundant proteins (fold change >1.5, P <0.05), including 46 up-regulated and 33 down-regulated proteins, were identified and mainly involved in carbon metabolism, pyruvate metabolism and proteasome pathways. These pathways indicated that VFC delayed cell metabolism and glycolysis by down-regulating the expression of metabolic enzymes. The tenderness was improved by up-regulating the expression of proteasome and m-calpain.

Reference:

BAI Y Q, YAN T J, FANG F, et al. DIA-based quantitative proteomic analysis on porcine meat quality at different chilling rates[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2573-2583. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250206.