撰文 | 存中一贯
人体基因组转录大量的长非编码RNA （long noncoding RNAs,lncRNAs） ，这些lncRNAs中只有不到1%的具有明确的功能【1】，包括封闭microRNAs，抑制翻译，形成大分子复合物，编码短肽以及调节蛋白或者RNA功能等【2-4】。这些lncRNAs的低序列保守性、低表达丰度以及细胞特异性表达谱等特点使其很难与不稳定的转录背景区分开来【5,6】。近期，CRISPRi和CRISPRa技术被用来鉴定lncRNAs的功能，虽然取得了许多成果，但Cas9依赖的方法往往会对靶点序列附近基因产生影响，进而影响对lncRNAs功能的鉴定，这是DNA依赖技术难以避免的技术缺陷。
近日，来自美国纽约大学的Neville E. Sanjana带领团队在Cell杂志发表了他们最新的研究成果，题目是Transcriptome-scale RNA-targeting CRISPR screens reveal essential lncRNAs in human cells，他们利用CRISPR-Cas13技术在5种细胞系中对lncRNAs进行了高通量筛选，这种方法避免了DNA层面基因编辑带来的脱靶效应和邻近基因扰动效应，筛选到大量对细胞增殖、凋亡、分化非常关键的lncRNAs。
研究人员设计了一个大约包含75000个gRNAs的文库，靶向6199个lncRNAs和其邻近的4390个PCGs （protein-coding genes, 蛋白编码基因） ，平均每个基因或者lncRNAs有8条gRNAs与之对应。另外，研究人员还构建了5种表达RfxCas13d的工程细胞系，分别是在HAP1，HEK293FT，K562，MDA-MB-231和THP1细胞系基础上。之后，研究人员在这些细胞系中转入表达gRNA文库的慢病毒，使得每个细胞接收一个gRNA，并诱导Cas13d的表达。接下来，研究人员分别在实验的第0,7和14天收集细胞并进行扩增子测序分析 （amplicon sequencing） ，并检测gRNAs丰度变化，分析其与细胞生理过程的关系。
在此实验中，研究人员不仅检测了一些公认的与细胞生存、增殖、分化相关的lncRNAs，还检测了未知功能的lncRNAs，以及一些关键PCGs。通过RNA-seq检测分析，研究人员发现，大约10%的lncRNAs显示出了明显的敲除，说明这些lncRNAs是细胞生存的关键基因，这个比例在5种细胞系中保持一致，也与Cas9筛选的关键PCGs比例接近。另外，不同细胞系间lncRNAs的表达并不一致，而且lncRNAs中关键基因的表达水平比较低。
研究人员进一步分析了在不同细胞系中都是关键基因的lncRNAs。研究人员一共鉴定了778个关键的lncRNAs，其中有477个（61%）具有细胞特异性，即只在一种细胞中表达；有255个（33%）具有部分共享特性，即在2-4种细胞系中表达；另外有46个基因（6%）在所有5种细胞系中都表达。与PCGs相比，关键lncRNAs的细胞特异性比例更高。而且，细胞特异性关键lncRNAs的表达丰度在不同细胞类型间相关性较低。
之后，研究人员对于在所有细胞系中都是关键基因的46个lncRNAs进行了深入分析。这其中包括MALAT1和MIR17HG，这两个基因在早先研究中已经证实分别与细胞运动、肿瘤转移和进展相关。除此之外，也有一些在之前的研究中没有发现的lncRNAs。研究人员选择了几种lncRNAs进行了单独的实验检测，发现MALAT1敲除会导致细胞停滞在G2-M期，另外两个之前未研究的XLOC_047988和XLOC_015918敲除则导致细胞停滞在G1期。以上结果证实这些lncRNAs确实和细胞增殖密切相关，说明研究人员的方法和结果都是可靠的。
在lncRNAs发挥功能的过程中，有些lncRNAs会通过影响周围的PCGs而发挥作用。研究人员在本研究中对此问题进行了深入探究，对5452对lncRNA和其附近的PCGs进行敲除，并分析其功能。结果显示，在检测的lncRNA-PCGs中，大部分都只有其中一个是关键基因，仅有一小部分是两者都是关键基因。例如，在HAP1细胞中，研究人员鉴定发现了590对lncRNA-PCG，其中至少一个是关键基因，但是仅有54对两者都是关键基因。
利用上述系统，研究人员还对发育和癌症进展中的关键lncRNAs进行鉴定。例如，肿瘤中关键lncRNAs的表达谱与非关键lncRNAs具有很大的不同。164个关键lncRNAs中，有76个表达上调，78个表达下调，而有10个则在不同肿瘤中具有不同的表达丰度。
总之，本研究利用Cas13系统对细胞中的lncRNAs以及其基因附近的PCGs进行了高通量筛选，通过数据分析，研究人员鉴定了许多与细胞生存、生殖、分化、凋亡相关的lncRNAs。重要的是，本研究建立了一种新的方法，能够避免Cas9系统带来的脱靶效应，更准确的分析细胞中关键基因的功能，为后续类似高通量基因筛选提供了新的研究思路。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.021
制版人：十一
参考文献
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