《食品科学》：华南理工大学许喜林副教授等：婴儿肠道源长双歧杆菌B2-01的益生特性及其高密度培养

益生菌是活的微生物，当摄入充足数量的益生菌时，会对宿主产生健康益处。肝脏作为人体重要的代谢器官，其受到脂肪性、酒精性、免疫性、药物性等内源或外源性损伤容易影响机体健康。具有抗氧化活性的益生菌具备潜在的减缓酒精性肝损伤的能力。

双歧杆菌（

Bifidobacterium

华南理工大学食品科学与工程学院的彭芸燕、钟舒莹、许喜林*从广州市3 月龄的健康婴儿粪便中分离筛选出一株长双歧杆菌B2-01，经前期较为系统的安全性评价，证明该菌株安全无毒，在此进一步对其包括体外抗氧化活性和肝损伤保护活性在内的益生特性进行研究。同时，由于益生菌在肠道定植，发挥益生功能，根据世界卫生组织的规定，需要益生菌的活菌数达到106 CFU/g以上，因此本研究还对长双歧杆菌B2-01的高密度培养进行研究，旨在为长双歧杆菌B2-01作为具有高应用价值的益生菌提供数据支持和理论依据。

1 菌株B2-01的分离筛选及种属水平鉴定

1.1菌株B2-01分离筛选及形态学观察

从广州市母乳喂养的健康3 月龄婴儿粪便样品中分离筛选到菌株B2-01。由图1可知，菌落形态特征为中间凸起，呈乳白色且不透明，表面光滑有光泽，边缘整齐。镜检后菌体为紫色，说明菌株为革兰氏阳性菌，菌体为棒状或Y型。

1.2菌株B2-01菌种鉴定

用NCBI数据库对菌株B2-01的16S rDNA序列进行BLAST比对，该菌株的16S rDNA序列与数据库中某些长双歧杆菌婴儿亚种菌株的16S rDNA序列相似度很高（＞99%），与长双歧杆菌婴儿亚种2533同源性达到100%。由图2可知，菌株B2-01与长双歧杆菌婴儿亚种在同一个分支，说明菌株B2-01与长双歧杆菌婴儿亚种亲缘关系最近，可以确定菌株B2-01属于长双歧杆菌。菌株B2-01已于2021年9月1日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No. 61911。

1.3菌株B2-01生理生化鉴定

由表4可知，菌株B2-01过氧化氢酶阴性，且可以利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等碳水化合物，长双歧杆菌婴儿亚种不能利用

L

L

2 体外抗氧化活性研究结果

DPPH自由基清除率越高，表明样品抗氧化能力越强。由图3A可知，B2-01和ATCC 15697的上清液清除DPPH自由基的能力均呈浓度依赖性增长，且低菌株浓度与中高菌株浓度组间差异明显。 低菌株浓度时B2-01上清液的DPPH自由基清除能力显著高于ATCC 15697（

P

羟自由基毒性较大，当其数量超过正常水平时会诱导DNA损伤、氧化线粒体、破坏细胞膜等，从而导致人体疾病或衰老。由图3B可知，在实验菌株浓度下，B2-01和ATCC 15697的上清液均对羟自由基有一定的清除能力，相比之下，在中低菌株浓度时ATCC 15697上清液的羟自由基清除率显著高于B2-01（

P

由图3C可知，虽然中低菌株浓度下ATCC 15697上清液的超氧阴离子自由基清除率略高于B2-01，但是随着菌株浓度升高至5×108 CFU/mL，B2-01上清液的超氧阴离子自由基清除率随菌株浓度升高增长迅速，最高可达到91.15%，而ATCC 15697上清液对超氧阴离子自由基的清除率仅从41.96%增长至70.06%，增幅较小，这说明B2-01具有更强的超氧阴离子自由基清除能力。

ABTS阳离子自由基溶液呈蓝绿色，在734 nm波长处有较强吸收峰，抗氧化剂可以与ABTS阳离子自由基反应使其褪色，因此溶液吸光度可以直观反映样品ABTS阳离子自由基清除能力。由图3D可知，B2-01和ATCC 15697上清液的ABTS阳离子自由基清除率均呈菌株浓度依赖性增长。当B2-01上清液在中高菌株浓度时，其ABTS阳离子自由基清除率分别为99.26%和99.47%，显著性分析结果表明清除率变化不明显，这说明B2-01上清液对于ABTS阳离子自由基的清除能力在中菌株浓度（5×107 CFU/mL）时趋于饱和，后续再增加菌株浓度对清除率影响较小。

由图3E可知，在所有实验菌株浓度下，各样品的抗脂质过氧化能力均随菌株浓度增大而升高，在最高菌株浓度下（5×108 CFU/mL），B2-01上清液的抗脂质过氧化能力略高于ATCC 15697，最高可达65.19%。

以DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基、ABTS阳离子自由基4 种自由基清除能力和抗脂质过氧化能力共计5 个指标评价菌株的抗氧化活性，结果表明，B2-01具有较强的抗氧化能力。

3 肝损伤保护活性研究结果

3.1菌株B2-01对L02细胞的毒性作用

由图4可知，2 株菌体积分数为40%的上清液处理L02细胞后，细胞存活率均不足30%，对L02细胞具有较强的毒性作用，而其余体积分数上清液培养L02细胞后，细胞存活率均在90%以上。因此选择体积分数为2%、4%、10%的上清液作为后续肝损伤保护研究的低、中、高水平。

3.2过氧化氢氧化损伤L02细胞模型建立

由图5可知，当过氧化氢浓度高于2.6 mmol/L时，L02细胞的存活率下降明显，3.4 mmol/L过氧化氢作用6 h后，L02细胞的存活率仅为56.48%。因此，选择3.4 mmol/L过氧化氢作为后续实验的造模条件。

3.3菌株B2-01对过氧化氢损伤L02细胞存活率的影响

由图6可知，相较于空白组，模型组细胞存活率显著降低至55.58%，表明过氧化氢损伤模型建立成功。加入不同浓度的B2-01和ATCC 15697上清液干预后，细胞存活率均呈浓度依赖性升高，说明B2-01和ATCC 15697上清液对过氧化氢损伤的L02细胞均具有良好保护作用。相比于模型组，高、中、低浓度组B2-01上清液作用后的细胞存活率均显著提高，最高浓度（上清液体积分数10%）下的细胞存活率可高达89.10%，明显高于ATCC 15697上清液作用后的细胞存活率74.48%，表明B2-01上清液能够较为有效地减轻肝细胞的氧化损伤。B2-01上清液具有较强的羟自由基清除能力，因此B2-01可能通过清除细胞内的羟自由基以缓解过氧化氢诱导的氧化损伤。结合体外抗氧化结果，B2-01上清液具有良好的抗氧化活性，具有缓解机体氧化应激的潜力。

3.4酒精性损伤L02细胞模型建立

饮食摄入的乙醇大部分由肝脏氧化代谢，代谢过程中会活化大量ROS，诱导机体产生氧化应激，导致肝脏细胞损伤。由图7可知，随着乙醇体积分数由2%逐渐提高至8%，L02细胞的存活率由80.24%下降至46.54%。当乙醇体积分数达到6%时，L02细胞的存活率为51.01%。因此，选择乙醇体积分数6%作为后续实验的造模体积分数。

3.5菌株B2-01对乙醇损伤的L02细胞存活率和肝酶活力的影响

由图8可知，模型组L02细胞存活率仅为58.33%，说明在体积分数6%乙醇的损伤作用下，L02细胞的存活率与空白组相比显著降低，酒精性肝细胞损伤模型建立成功。但在不同浓度的B2-01和ATCC 15697上清液处理24 h之后，样品组细胞存活率显著高于模型组，说明B2-01和ATCC 15697上清液对乙醇损伤的L02细胞具有良好保护作用，同时存活率提高程度呈明显的剂量依赖性。相比于模型组，中剂量组B2-01上清液作用后的细胞存活率提升至85.67%，与ATCC 15697上清液作用后的细胞存活率86.84%无明显差异，而高剂量（上清液体积分数10%）组B2-01上清液作用后的细胞存活率可高达91.38%，高于同体积分数ATCC 15697上清液作用后的细胞存活率90.70%。乙醇代谢过程会产生大量自由基，引起氧化应激，使肝细胞损伤，B2-01上清液对于乙醇损伤的保护作用可能与其凭借自身抗氧化能力有效清除自由基有关。以细胞存活率作为评估指标，对比过氧化氢损伤模型研究结果可知，B2-01上清液对乙醇损伤的L02细胞也具有较好保护作用，并且略强于对过氧化氢损伤的保护作用。

转氨酶ALT和AST主要分布在肝细胞内，如果肝细胞受到损伤，便会泄漏至胞外。由图9可知，相比于空白组细胞，模型组细胞上清液中ALT和AST活力分别显著提升至18.30、14.90 U/L，表明乙醇损伤模型建立成功。加入不同体积分数的B2-01上清液干预后，培养上清液中AST活力相较模型组显著降低，当B2-01上清液处于中剂量（上清液体积分数4%）时，AST活力最低降至9.09 U/L，对细胞的修复作用最强。同样地，中高剂量B2-01上清液也能显著降低胞外ALT活力，但低剂量组B2-01上清液基本没有减少ALT向胞外泄漏的作用，中剂量组（上清液体积分数4%）B2-01上清液能使ALT活力最低降至14.36 U/L。中高剂量B2-01上清液干预受损细胞后，胞外AST和ALT活力几乎降至与空白组相当，这说明B2-01上清液对于乙醇诱导损伤的L02细胞具有较强的保护作用。

4 高密度培养研究结果

4.1不同营养成分对活菌数的影响

4.1.1 碳源的影响

由图10可知，随着葡萄糖和乳糖质量分数的升高，发酵液中的活菌数均呈先增加后减少的趋势。添加过多的葡萄糖和乳糖会使发酵菌液的渗透压增大，反而会抑制菌体细胞的生长。当葡萄糖的质量分数为3%时，获得最大的活菌数，为（9.93±0.32）×108 CFU/mL，当乳糖的质量分数为3%时，获得最大的活菌数，为（9.23±0.21）×108 CFU/mL。

4.1.2 氮源的影响

由图11可知，当酵母浸提粉的质量分数为3%时，B2-01活菌数最高，达到（20.27±0.90）×108 CFU/mL。随着酵母浸提粉质量分数的升高，活菌数呈先增加后减少的趋势，说明培养基中的酵母浸提粉过多反而会抑制菌体的生长。当细菌学蛋白胨的质量分数为2%时，发酵液中的B2-01活菌数最高，为（11.33±0.76）×108 CFU/mL。

4.1.3 生长因子的影响

由图12可知，当西红柿汁的质量分数为1.5%时，B2-01活菌数最高，为（8.57±0.15）×108 CFU/mL，西红柿汁对B2-01活菌数的影响较小，这一结果与王建等的研究结果相似。当低聚半乳糖的质量分数为2.0%时，B2-01活菌数最高，达到（11.37±0.40）×108 CFU/mL。随着低聚半乳糖质量分数的升高，活菌数呈先增加后减少的趋势，说明培养基中的低聚半乳糖过多反而会抑制菌体的生长。

4.1.4 无机盐的影响

由图13可知，MRS肉汤培养基中硫酸镁和硫酸锰的质量分数分别为0.02%、0.005%，继续增大其质量分数，活菌数均没有提高。可能是因为MRS肉汤培养基中的硫酸镁和硫酸锰已经满足B2-01菌株生长繁殖的需要，硫酸镁和硫酸锰对B2-01的促增殖作用在质量分数分别为0.02%、0.005%时已趋于饱和，继续增大其质量分数不能表现出明显的增菌效果。

4.2Plackett-Burman试验结果

由单因素试验结果可知，当MRS肉汤培养基中分别含有质量分数3.00%酵母浸提粉、2.00%细菌学蛋白胨、3.00%葡萄糖、3.00%乳糖和2.00%低聚半乳糖时，获得的B2-01活菌数是各自单因素试验中最高的，因此，根据各单因素试验结果选择高、低2 个水平，试验设计与结果如表5所示。

由表6可知，葡萄糖添加量的效应值为负，应该减小，而其他4 个因素的效应值为正，应该增加。由贡献率的大小可知，这5 个因素对模型影响的大小依次为：酵母浸提粉＞葡萄糖＞乳糖＞细菌学蛋白胨＞低聚半乳糖。试验整体因素模型P值为0.035 8＜0.05，说明Plackett-Burman试验的结果具有可信度。因此，最终选择酵母浸提粉、葡萄糖和乳糖3 个影响因素进行下一步的最陡爬坡试验。其余2 个因素则根据每一因素的效应值进行取值，即选择细菌学蛋白胨添加量3.00%、低聚半乳糖添加量2.50%。

4.3最陡爬坡试验结果

由图14可知，最陡爬坡试验结果呈现先增高后降低的趋势，在4号试验点处出现最高点，该点处酵母浸提粉添加量3.50%、葡萄糖2.50%、乳糖2.75%，此时长双歧杆菌B2-01的活菌数达到最大，为（4.07±0.21）×109 CFU/mL。该点即为下一步培养条件Box-Behnken试验设计的中心点。

4.4Box-Behnken试验结果

由表7、8可知：模型的P值为0.001 0＜0.05，模型显著，具有可信度；决定系数

R

Y

A

B

C

Y

A

B

C

AB

AC

BC

A

B

C

A

B

C

结论

本研究通过16S rDNA测序和生理生化鉴定，从广州市3 月龄婴儿粪便中分离鉴定出一株长双歧杆菌B2-01。以DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基、ABTS阳离子自由基4 种自由基清除能力和抗脂质过氧化能力共计5 个指标评价B2-01的体外抗氧化活性，发现5×108 CFU/mL的B2-01发酵上清液DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基、ABTS阳离子自由基4 种自由基清除能力和抗脂质过氧化能力均强于对照菌株ATCC 15697。肝损伤保护活性结果显示，在过氧化氢损伤模型和酒精肝损伤模型中，DMEM完全培养基中体积分数10% B2-01发酵上清液可使L02细胞存活率分别提高至89.10%和91.38%，均高于对照菌株ATCC 15697（细胞存活率分别提高至74.48%和90.70%），同时，中高浓度B2-01上清液能使酒精损伤肝细胞胞外AST和ALT活力几乎降至与空白组相当，表明B2-01上清液对于乙醇诱导损伤的L02细胞具有较强的保护作用。高密度培养研究优化后的最佳培养条件确定为酵母浸提粉添加量3.45%、葡萄糖2.48%、乳糖2.79%、细菌学蛋白胨3.00%、低聚半乳糖2.50%。在此优化条件下，发酵液的活菌数最高可达4.20×109 CFU/mL，能够达到优化前（7.71×108 CFU/mL）的5.45 倍。本研究为发掘长双歧杆菌B2-01的益生功能特性提供了参考，旨在为长双歧杆菌B2-01作为具有高应用价值的益生菌提供数据支持和理论依据。

本文《婴儿肠道源长双歧杆菌B2-01的益生特性及其高密度培养》来源于《食品科学》2024年46卷第1期28-39，作者：彭芸燕，钟舒莹，刘冬梅，许喜林*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20230728-306。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学食品与酿酒工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）

为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办“第十二届食品科学国际年会”。本届年会将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）