《AHM》山东中医药大学秦松：改良型鱼皮胶原蛋白基水凝胶用于糖尿病伤口愈合！

➤ 研究背景

糖尿病足溃疡是糖尿病的严重并发症之一，治疗时间较长，给患者带来严重的经济负担，并且有瘫痪的风险。糖尿病伤口的高血糖微环境，易受到严重的氧化应激和细菌生长的影响，因此，减少氧化应激和抑制伤口部位的细菌生长是治疗的关键策略。研究发现，在糖尿病伤口中，高葡萄糖（HG）环境会抑制谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）和铁蛋白重链 1 （FTH1） 的活性，导致 Fe2+ 积累和活性氧（ROS）产生，而铁死亡会加剧芬顿反应，促进氧化应激。另外，铁作为细菌蛋白质的重要辅助因子，在细菌生长过程中，不仅控制着它们的细胞功能，并参与关键的代谢途径。细菌已经进化出各种复杂的机制来获得 Fe3+ 以维持其生长和新陈代谢。

水凝胶具有细胞外基质样结构和优异的生物相容性，可长时间保持伤口水分，是伤口敷料的主要选择。胶原蛋白、藻酸盐、壳聚糖和透明质酸等是制备水凝胶的天然聚合物，其中含量最丰富的胶原蛋白在所有愈合阶段的组织结构和伤口愈合中起着重要作用，目前，工业用胶原蛋白的主要自猪和牛等陆生哺乳动物，存在疾病传播的风险，而从鱼皮中提取的鱼皮胶原蛋白 （Co）具有较大的生物安全性，是理想替代品，但其热稳定性和机械性能较差，限制着其临床应用。

原儿茶醛（PCA）是一种天然酚类化合物，具有优异的抗炎和抗菌特性，常用于治疗冠心病和伤口感染。其邻苯二酚基团赋予其清除活性氧（ROS）的能力，可有效缓解糖尿病伤口的氧化应激。研究发现，PCA可通过邻苯二酚基团与Fe2+和Fe3+形成稳定的螯合物，降低游离 Fe2+ 和 Fe3+ 浓度，从而减少氧化应激并抑制细菌生长，同时干扰细胞铁死亡和破坏细菌铁稳态。原儿茶醛-铁（III）螯合物（PCA@Fe）不仅保留了PCA的抗氧化性能，还可以增强水凝胶的机械强度和光热性能，在糖尿病伤口治疗中减少氧化应激和抑制细菌感染。

➤ 主要内容

基于此，山东中医药大学秦松团队研究开发了一种创新的多功能钴基水凝胶——CFP，通过钴（Co）、原儿茶醛（PCA）与铁离子（Fe³⁺）的协同作用构建而成。该水凝胶经席夫碱键交联氨基（—NH₂）和醛基（—CHO）形成，显著增强了机械强度与热稳定性，而PCA与Fe³⁺形成的螯合物 PCA@Fe 进一步优化了其力学性能并赋予高效光热转换特性。CFP不仅保留了钴促进血管生成和胶原重塑的生物学功能，还通过螯合Fe²⁺有效抑制芬顿反应，减少脂质过氧化，从而缓解氧化应激及铁下垂引起的线粒体损伤。同时，PCA对Fe³⁺的螯合作用破坏了细菌铁稳态，结合光热刺激协同增强了抗菌活性，显著改善了糖尿病伤口的细菌感染管理，为糖尿病伤口治疗提供了集抗氧化、抗菌与促修复功能于一体的新型材料解决方案。

Scheme：CFP 合成和治疗机制的示意图

➤ 图文速览

PCA@Fe 和 CFP 的表征和性质

研究制备了多功能钴基水凝胶（CFP），通过紫外光谱、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等方法证实了PCA@Fe螯合物的形成，其中Fe³⁺和Fe²⁺共存，且PCA可能作为还原剂参与铁离子价态转化。扫描电镜（SEM）显示CFP具有多孔结构，有利于吸收伤口渗出物，同时流变学测试表明其在25-45°C范围内储能模量（Gʹ）稳定，且具备动态弹性网络和自修复能力，1%至1000%应变循环后模量可完全恢复。溶胀实验表明CFP20:1 在2小时内达到溶胀平衡，体外释放和降解实验显示72小时累积释放率约48.2%，降解率达64.2%，体内植入实验进一步验证其3天内降解83.6%，表明其具备缓释功能、优异降解性能及生物安全性。此外，CFP展现出自愈合特性，可自发重组，并在手指关节弯曲时保持紧密粘附，凸显其在动态伤口环境中的实际应用潜力。

Figure 1、 A） PCA@Fe 的紫外-可见光谱。B） PCA@Fe 的拉曼光谱。C） Co 和 CFP 的 FT-IR 光谱。D） CFP 20：1 在室温下的宏观和 SEM 图像。比例尺为 200 μm。E） 不同比例的 CFP 的温度扫描。F） 不同比例 CFP 的角度频率扫描曲线。G） 不同比例的 CFP 的流变自愈特性，应变从 1% 切换到 1000%，持续 3 个周期。H） 不同比例的 CFP 的溶胀率 （ n = 3）。I） CFP 中 PCA@Fe 的累积释放率 （ n = 3）。J） 宏观的自我修复显示，从原始的 CFP 到破损的 CFP，再到愈合的 CFP。K） CFP 在手指上的弯曲试验。

生物安全性

通过多维度实验验证了CFP材料的生物安全性与应用潜力。在体外实验中，250µg/mL Co、1µg/mL PCA、10µg/mL PCA@Fe及500µg/mL CFP均未对细胞产生显著毒性，且在高糖环境下显著提升了L929成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的存活率，表现出对葡萄糖诱导毒性的保护作用。特别值得注意的是，CFP联合近红外光热处理未降低细胞存活率，证实其光热安全性。体内实验进一步显示，SD大鼠皮下植入CFP 14天后，主要脏器H&E染色未见病理改变，血液生化指标（包括白细胞、红细胞、血小板等）均保持正常范围。这些结果表明，CFP具有优异的生物相容性，可作为糖尿病伤口修复等临床场景的安全候选材料。

PCA@Fe 和 CFP 的光热分析

研究系统评估了CFP材料的光热特性，以探索其在光热治疗中的潜力。实验表明，PCA@Fe在839nm近红外波段具有强吸收，且808nm近红外光因其生物安全性被选为实验光源。与PBS组相比，PCA@Fe展现出显著的光热效应。进一步研究发现，掺入钴的CFP保持了优异的光热性能，其温度升高与近红外光强度呈正相关。在1.0 W cm-2 功率密度下，CFP温度稳定在67.5°C，实现了治疗效果与生物安全的最佳平衡。此外，CFP在多次光热循环中表现出高稳定性，且PCA@Fe和CFP的光热转换效率分别达79.97%和77.36%。红外热成像直观验证了两者稳健的光热特性。这些结果共同表明，CFP是一种具有可控温度管理能力和高稳定性的潜在临床光热材料。

Figure 3、A） PBS 和 PCA@Fe 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm−2） 下 60 秒的温度升高曲线 B） PBS 和 CFP 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm−2） 下 180 秒的温度升高曲线 C） CFP 在不同功率密度下 808 nm 激光照射下 180 秒的加热曲线 D） CFP 在 808 nm 激光下通过四个加热循环的光热稳定性和冷却过程。E） 在 808 nm 激光照射下，在 1.0 W cm-2 下 90 秒以及关闭激光器后的自然冷却过程（黑色曲线）和 -Ln（θ） 的线性时间数据（红色曲线）。F） PCA@Fe 和 CFP 基团 180 s 的红外热图像。

CFP通过抑制铁死亡来缓解氧化应激反应

实验表明，在高糖（HG）环境下，CFP显著降低成纤维细胞内活性氧（ROS）水平及线粒体膜电位损伤，恢复线粒体功能。其作用机制包括：通过PCA的多酚结构螯合过量Fe²+，减少铁离子积累；上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和铁蛋白重链1（FTH1）表达，抑制脂质过氧化关键介质丙二醛（MDA）生成，同时提升还原型谷胱甘肽（GSH）水平，形成抗氧化防御体系。值得注意的是，CFP中的Fe³+未加剧脂质过氧化反应，反而通过稳定配位限制铁介导的氧化损伤，且铁输出蛋白FPN表达增强进一步减少细胞内铁蓄积。这些协同效应有效抑制铁死亡通路，保护细胞免受氧化应激损伤，为CFP作为糖尿病伤口治疗材料提供了分子机制层面的证据，突显其通过调控铁代谢与氧化还原平衡促进伤口愈合的潜力。

Figure 4、 A） 使用 DCF 作为荧光探针 （ n = 3） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中 DCF 的荧光图像。比例尺为 100 μm。B） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中 DCF 的相对荧光强度。数据表示为均值±标准差 （SD） （ n = 3），显著差异（单因素方差分析 （ANOVA））：** p < 0.01，*** p < 0.001。C） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理后 HG-L929 中用 JC-1 探针测量的线粒体膜电位的变化。红色和绿色荧光分别对应于 JC-1 聚集体和单体 （ n = 3）。比例尺为 100 μm。D） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理后 HG-L929 中 JC-1 的红色荧光强度与绿色荧光强度之比的测定。数据表示为均值± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 使用 FerroOrange 作为荧光探针 （ n = 3） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中 FerroOrange 的荧光图像。比例尺为 50 μm。F） FerroOrange 在用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中的相对荧光强度。数据表示为均值± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。G） 用免疫荧光检测 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中的 GPX4 （ n = 3）。比例尺为 100 μm。H） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中 GPX4 的相对荧光强度。 数据表示为均值± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。I） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 孵育 24 小时后 GPX4、FTH1 和 FPN 的蛋白质印迹图像 （ n = 3）。J） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 细胞中 LPO 的相对荧光强度。数据表示为 SD ±平均值 （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。K） PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 的 MDA 含量。数据表示为均值 ± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。L） PCA、PCA@Fe、CFP 处理的 HG-L929 的 GSH 含量。数据表示为均值± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

Co和CFP对细胞增殖和血管生成的影响

CFP通过多维度生物学效应促进糖尿病伤口愈合。实验采用高糖（HG）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和成纤维细胞（L929）模型，通过划痕试验、透孔试验、细胞增殖分析及血管生成试管实验等系列技术，发现钴离子（Co²⁺）与CFP水凝胶均显著增强内皮细胞迁移能力、成纤维细胞增殖活性及血管新生能力。具体表现为：CFP组细胞迁移速率提升、血管样管腔结构形成增加，且成纤维细胞胶原蛋白合成相关功能恢复。研究揭示钴基材料通过双重机制发挥作用——既通过释放钴离子直接激活细胞活性，又借助CFP载体实现生物活性成分的缓释与靶向作用。这些发现印证了钴基水凝胶在糖尿病微环境中修复血管生成障碍与胶原重塑缺陷的潜力，为其作为新型伤口敷料提供了关键机制依据。

Figure 5、 A） 在 12 、 24 和 48 小时 （n = 3） 用 Co 和 CFP 处理的 HG-L929 中的细胞划痕图像。比例尺为 100 μm。B） 在 12、24 和 48 小时时不同组之间的细胞迁移水平的定量。数据表示为均值± SD （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。C） 用 Co 和 CFP 处理的 HG-HUVECs 的迁移图 （n = 3）。比例尺为 100 μm。D） 定量分析用 Co 和 CFP 处理后迁移的细胞数量。数据表示为 SD ±平均值 （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。E） Co 和 CFP 处理后 HG-HUVECs 中管形成的体外图像 （n = 3）。比例尺为 100 μm。F） 用 Co 和 CFP 处理的 HG-HUVECs 中形成的管数的定量分析。数据表示为均值± SD （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。G） 用 Co 和 CFP 处理的 HG-L929 细胞的增殖 （n = 3）。比例尺为 100 μm。H） Co 和 CFP 处理的 HG-L929 增殖数的定量分析。数据表示为 SD ±平均值 （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。

CFP和CFP+NIR的体外抗菌活性

受PCA独特酚结构和CFP优异光热性能启发，CFP材料在近红外光激活下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌展现出显著抗菌效果。实验通过细菌菌落计数、生物膜染色及3D共聚焦显微镜观察等方法证实，CFP+NIR组几乎完全抑制细菌生长，并严重破坏细菌生物膜结构。进一步分析显示，PCA与Fe³+的稳定螯合作用限制了细菌对铁离子的吸收，而光热效应则直接导致细菌膜损伤和细胞内容物泄漏，从而协同增强抗菌活性。这些发现为CFP作为光热激活型抗菌材料在生物医学领域的应用提供了有力支持。

Figure 6、 A） 金黄色 葡萄球菌和 大肠杆菌 悬浮液用不同组（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）处理后的板涂层实验 （ n = 3）。B） 3D CLSM 图像描绘了暴露于各种处理（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）后生物膜的活/死染色。比例尺为 50 μm。C） 用不同组（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）处理的 金黄色葡萄球菌 和 大肠杆菌 悬浮液的 OD600 值。数据表示为 SD ±平均值 （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。D） 检测不同组（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）的金黄色葡萄球 菌 和 大肠杆菌 活力。数据表示为均值± SD （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 用不同组 （PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR） 处理后的 金黄色 葡萄球菌和 大肠杆菌 蛋白泄漏 （ n = 3）。数据表示为 SD ±平均值 （ n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。

CFP+NIR通过抑制铁稳态和热刺激细菌诱导氧化应激导致细菌死亡

通过转录组学分析揭示了CFP+NIR协同抗菌的分子机制。实验发现，CFP在近红外光激活后，通过PCA对Fe³+的螯合作用显著抑制细菌铁离子吸收，同时光热效应引发细胞热损伤，二者协同导致大肠杆菌铁稳态失衡。转录组数据显示，处理组562个基因上调、570个基因下调，其中铁硫簇代谢、铁离子结合相关基因显著下调，而氧化应激响应基因上调。KEGG通路分析进一步表明，硫代谢和生物膜形成通路受抑制，氧化磷酸化过程被激活。机制上，铁稳态破坏直接削弱细菌呼吸链功能，导致ATP合成受阻及抗氧化防御崩溃，最终通过氧化应激加剧和能量代谢紊乱引发细菌死亡。该研究阐明了CFP作为光热-化学协同抗菌剂的双模态作用路径。

Figure 7、 A） 维恩图显示 PBS 和 CFP + NIR 处理的大 肠杆菌 的交集靶基因。B） 火山图说明了差异基因表达谱，灰色为无意义基因，红色为上调基因，蓝色为下调基因。C） 热图显示了参与细菌代谢途径的基因的表达水平，其中红色表示高表达，蓝色表示低表达。D） 下调基因的 GO 富集分析。E） 上调基因的 GO 富集分析。F） 下调基因的 KEGG 通路富集分析。G） 上调基因的 KEGG 通路富集分析。

CFP加速糖尿病伤口愈合

CFP复合水凝胶协同近红外光疗（CFP+NIR）对糖尿病慢性伤口愈合的多模态调控作用。通过构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型，研究者发现CFP+NIR组在14天治疗周期内呈现最优的伤口愈合率，其愈合速度显著优于市售3M敷料组及单纯CFP组。机制上，CFP通过PCA@Fe的Fe³+螯合作用与光热效应协同实现双重抗菌：CFP+NIR组伤口细菌菌落数较3M组减少98.7%，光热治疗使局部温度升至50.8°C，有效破坏细菌生物膜并引发蛋白质泄漏。此外，CFP的3D多孔结构赋予其优异止血性能，在肝出血模型中失血量较商用纱布减少76.4%。转录组学分析进一步揭示，CFP+NIR通过抑制铁硫簇代谢相关基因表达、干扰细菌铁稳态，并诱导氧化应激反应实现杀菌效应。该研究证实CFP作为集光热抗菌、促血管生成、胶原重塑及止血功能于一体的智能生物材料，在糖尿病伤口治疗领域具有显著临床转化潜力。

图 8、A） 动物实验设计示意图。B） 描绘 1 型糖尿病大鼠在施用 3M、CFP 和 CFP + NIR 后不同时间点（1、3、7 和 14 天）全层皮肤缺损的代表性图像 （n = 3）。比例尺为 0.5 厘米。C） 不同组 （n = 3） 14 天内伤口闭合的痕迹。D） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 给药 3、7 和 14 天的 1 型糖尿病大鼠模型的伤口愈合率评估。数据表示为均值± SD （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 从糖尿病伤口中提取的细菌集落形成单位 （CFU） 的体外培养计数 （n = 3）。F） CFP + NIR 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm-2） 下 90 秒 （n = 3） 的红外热图像。G） CFP + NIR 在 808 nm 激光照射 90 s 下的加热曲线。数据表示为 SD ±平均值 （n = 3）。H） 评估对 CFP 治疗肝脏的出血影响的分析。数据表示为 SD ±平均值 （n = 3），显著差异 （学生检验）： *** p < 0.001。

CFP在不同阶段加速了糖尿病伤口愈合的恢复

通过构建糖尿病大鼠模型，研究发现CFP在炎症期（3天）显著减少中性粒细胞和巨噬细胞浸润，其抗菌效能源于PCA@Fe的Fe³+螯合作用与光热效应协同抑制细菌增殖；在血管生成期（7天），CFP促进CD31阳性内皮细胞密度增加，钴元素与PCA@Fe的协同作用加速血管再生；在胶原重塑期（14天），CFP显著提升Ⅰ型胶原（Col1）表达，形成致密纤维网络。特别地，CFP+NIR组通过光热调控实现炎症-血管生成-胶原重塑的级联优化，其治疗效果显著优于市售3M敷料。H&E染色与Masson染色结果证实，CFP通过多靶点干预机制，有效克服糖尿病伤口过度炎症、血管生成障碍及胶原代谢紊乱等病理瓶颈，为开发智能型伤口敷料提供了科学依据。

图 9、A） 第 3 天、第 7 天和第 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的 1 型糖尿病伤口的 H&E 染色图像。比例尺为 100 μm。B） 第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的糖尿病伤口中 CD31 表达的免疫组织化学染色图像。比例尺为 100 μm。C） 术后 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的 1 型糖尿病伤口的 Masson 三色染色。比例尺为 100 μm。D） 第 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的糖尿病伤口中 Col1 的免疫荧光图像。比例尺为 100 μm。

CFP可以通过抑制伤口部位的铁死亡来缓解氧化应激反应，并通过促进M1至M2巨噬细胞的极化来减少炎症

实验表明，CFP在第7天通过上调GPX4和FTH1表达，降低MDA水平并提升GSH含量，有效缓解伤口组织氧化应激及铁死亡。其作用机制包括：PCA@Fe螯合过量Fe²+减少脂质过氧化，同时钴元素促进抗氧化蛋白合成。此外，CFP通过调节巨噬细胞极化，在第3天显著降低M1型巨噬细胞标志物iNOS表达，提升M2型标志物CD206水平，加速炎症向增殖阶段过渡。CFP+NIR组更通过光热效应增强抗菌作用，减少IL-6等炎症因子表达。这种双重调控策略——既通过铁代谢干预抑制氧化损伤，又通过免疫调节控制炎症反应——使CFP成为改善糖尿病慢性伤口病理微环境、促进组织修复的创新型生物材料。

图 10、A） 荧光显微镜图像，描绘了治疗后第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的 1 型糖尿病大鼠伤口部位的 DHE 染色。比例尺为 100 μm。B，C） 免疫荧光图像显示第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的糖尿病大鼠伤口中 GPX4 和 FTH1 的表达。比例尺为 100 μm。D） 免疫荧光图像显示第 3 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗后糖尿病大鼠伤口中的 INOS 和 CD206。比例尺为 100 μm。E） 第 3 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的糖尿病伤口中 IL-6 表达的免疫荧光图像。比例尺为 100 μm。F-H） 定量分析第 7 天用 3M、CFP 和 CFP + NIR 处理的伤口中 DHE、GPX4 和 FTH1 的相对免疫荧光强度。数据表示为均值 ± SD （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：* p < 0.05，*** p < 0.001。I） 第 3 天用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治疗的伤口中 INOS 与 CD206 免疫荧光强度比率的定量评估。数据表示为 SD ±平均值 （n = 3），显著差异（单因素方差分析）：*** p < 0.001。

参考文献

Xinrong Geng, Wenjun Li, Jinqi Qu, Qi Wang, Tuanjie Che, Libo Yan, Hongli Cui, Dongting Liu, Song Qin

Modified Fish-Skin-Collagen-Based Hydrogels with Antioxidant and Antibacterial Functions for Diabetic Wound Healing

DOI: 10.1002/adhm.202501456

Pub Date : 2025-06-16

https://doi.org/10.1002/adhm.202501456

来源：纳米医界探索