摘要：细胞系开发是治疗性糖蛋白开发过程中的关键步骤。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制剂工业生产中使用最常用的哺乳动物宿主细胞系统。CHO细胞用于异源重组蛋白表达的主要应用在于将异位DNA稳定地引入CHO宿主细胞基因组的相对简单性。自1980年代后期CHO细胞首次用作生物制剂工业生产的表达宿主以来，稳定的基因组转基因整合几乎完全通过随机整合实现。从那时起，由于缺乏可行的替代品，随机转基因整合已成为生成稳定CHO生产细胞系的金标准。然而，最终证明这种方法对细胞系开发过程构成了重大挑战，例如增加诱导细胞系不稳定的风险。近年来，新的高效（半）靶向转基因整合系统的重大发现为细胞系开发领域的技术革命铺平了道路。这些先进的方法包括转座酶、重组酶或Cas9核酸酶介导的位点特异性基因组整合技术的应用，该技术能够将转基因表达盒无痕地转移到宿主细胞基因组内的转录活性基因座中。本文总结了用于CHO细胞系开发的转基因整合技术领域的最新进展，并将其与已建立的随机整合方法进行了比较。此外，讨论了（半）靶向整合技术的优势和局限性，并概述了生物制药行业的优势和机遇。

关于CHO细胞系开发中传统使用的随机转基因整合技术和半靶向整合技术，在此不作为重点关注，如果感兴趣可以参考原文相应内容。

图1.细胞系开发工作流程中当前使用的转基因整合技术的示意图概述

图2.使用标准随机转基因整合构建克隆型mAb生产细胞系的工作流程示意图

下面将重点关注CHO细胞系开发的最前沿技术：靶向转基因整合技术

1.位点特异性（靶向）转基因整合（SSI）

虽然与半靶向随机转染相比，转座酶能够改善转基因的整合，从而以更可控和精确的方式进行整合，但也可以选择在宿主细胞基因组的特定预定义位置完全受控地整合转基因（图6）。基于位点特异性整合（SSI）的靶向CLD的目标是实现稳定和可预测的基因表达，因为拷贝数的数量和定义基因座的表达强度已明确。与基于STI的CLD相比，SSI方法旨在加快开发时间并减少筛选工作，以确定具有增强生物加工特性的优质克隆生产细胞系。

图6.使用着陆垫或核酸酶介导的转基因整合的位点特异性整合方法

对于转基因的靶向整合，可以利用包含着陆垫的修饰宿主细胞系来生成重组蛋白生产细胞系，并在预定义的位置进行单次整合。或者，未修饰的宿主细胞可以与核酸酶结合使用，在所需的基因组热点处插入双链断裂，以特异性整合转基因。单细胞克隆导致高度均一的克隆。

1.1.位点特异性转基因整合的机制

在CHO领域之外建立了几种机制，可以将转基因插入预定义的基因座，例如使用酶整合进行位点特异性重组（SSR），利用同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）等DNA修复机制，或在引入特异性双链断裂（DSB）后使用基因组编辑技术进行同源重组（HR）。虽然HR涉及在大约500-3000bp的两个同源臂之间交换转基因，对所需的靶向基因组整合位点具有高特异性，但它也处理相当低的整合效率。因此，HR很少用于生成工业CHO制造细胞系。基于SSI的CLD的一个更突出的例子是利用SSR，它涉及重组酶以整合所需的DNA片段（表达盒）。SSR相对于HR的一个优势是表达盒两侧的识别位点相当短，这些位点可被特异性重组酶识别，从而获得高特异性和效率。由于识别位点对每种重组酶都是特异性的，因此可以组合不同的重组酶系统，从而为CLD方法提供多种附加选项。CHO细胞中使用的相关重组酶分为酪氨酸SSR或丝氨酸SSR。在噬菌体P1中鉴定的Cre-重组酶-loxP（Cre-LoxP）以及从酿酒酵母中分离的flippase-flippase识别靶标（Flp-FRT）系统属于酪氨酸重组酶类，它们的作用方式相当。两种重组酶都通过首先进行单链断裂，然后进行链交换和连接来催化连续的单链交换。丝氨酸SSR的常用例子是来自链霉菌噬菌体φC31的φC31整合酶或在分枝杆菌噬菌体Bxb1中鉴定的Bxb1整合酶。与酪氨酸SSR相比，丝氨酸重组酶催化DSB和一步转基因盒交换。对于这两类重组酶，都必须预定义着陆垫，它们是宿主细胞系基因组中要整合重组表达盒的特定位置。着陆垫应表现出高转录率、稳定性和对插入重组酶识别序列的接受度。这种情况代表了SSR针对基于SSI的CLD方法的主要缺点之一。首先，在CHO基因组中鉴定高度活跃和合适的基因座很复杂，需要大量的实验筛选和表征工作。此外，将识别位点整合到宿主细胞中，并将用于重复CLD活动的克隆宿主细胞系的开发又是一个关键过程，因为需要评估所得克隆的工艺性能属性。

最后，如果已经确定了一个有前途的SSR位点并成功用作着陆点，则很可能需要CHO基因组中的多个整合位点才能可靠且足够高的重组治疗性蛋白表达。因此，必须重复筛选和插入着陆垫以及分离有前途的克隆宿主细胞系。与随机生成的细胞系相比，只有几个着陆垫的SSI平台往往会导致克隆的蛋白质表达较低。然而，正如Scarcelli等人所描述的，某些分子的较低蛋白质表达是可以接受的，特别是如果可以通过SSI方法缩短开发时间表。另一种不同的策略涉及应用基于SSI的CLD来快速生成适合快速启动早期临床研究的生产细胞系，同时建立基于RTI的高产细胞系，用于潜在的后期商业供应。然而，这需要每个开发计划进行两次独立的CLD活动，并且需要对不同细胞系产生的原料药材料进行大量的可比性活动。尽管如此，还是成功地实施了几种依赖于HR或SSR的SSI-CLD方法以加快时间表。

1.2.CHO细胞中转录安全港（热点）的鉴定

如上所述，有效的基于SSI的CLD平台的第一步是确定有前途、高度活跃和稳定的基因组位置，通常称为安全港或热点。寻找和评估SSR的安全港可能是一项费力、困难且成本高昂的任务，因为对这种基因组位点的需求多种多样且具有挑战性。鉴定转录活性热点的一种方法包括对随机CLD方法产生的高产细胞系进行密集表征。然而，由于这些顶级克隆通常具有几个不同的整合点和高度差异化的转基因整合结构，因此很难确定高蛋白表达的最佳遗传位点。此外，高性能克隆的优势是基于高于平均水平的整合数与高转录活性基因座和有益的整体转录组谱相结合的偶然性。因此，为SSR选择单个整合点限制了新生成的用于重组酶介导的盒交换（RMCE）的宿主细胞的表达能力。由于这些有针对性的方法在识别安全港方面成功有限，因此需要替代技术来释放基于SSI的CLD活动的潜力。

因此，对安全港区域进行了系统和全局筛选方法，以生成有前途的SSR宿主细胞。其中一项技术涉及研究两种不同细胞系之间的表观遗传差异及其对基因表达的影响。为此，使用Hi-C数据来评估染色质结构，揭示了拷贝数变异和染色体重排。此外，在细胞系发育过程中，染色质区室发生改变，影响基因表达。通过详细比较，证实了染色质结构的破坏与基因表达水平改变之间的联系。因此，以具有高且稳定表达的比较方法确定了新的安全港，可用于有针对性的整合方法。Hertel等人发布了一种分析表观遗传学数据以确定安全港的替代程序，他们利用染色质免疫沉淀-seq数据来筛选H3K4me和H3K27ac水平高但H3K9me3水平低的基因组区域，这分别与表达激活或沉默有关。通过应用额外的标准以避免干扰表达的基因，表征了709个潜在的安全港。CRISPR-Cas9介导的这些热点选择中的位点特异性整合证明了这些基因组位点对SSI方法的适用性。除了关注表观遗传学外，还进行了感染复数低的慢病毒筛选，以揭示有希望的整合基因座。通过用编码不稳定GFP的慢病毒转导CHO细胞，分离具有高荧光的细胞，并将这些细胞用于RMCE，将GoI插入具有前景热点的细胞中，产生了只有一个转基因拷贝的高产CHO细胞，可以作为新的生产宿主细胞系。最后，利用替代起始密码子CTG表达嵌入在RMCE兼容表达盒中的表面报告基因CD4发表了第三种筛选方法。虽然替代起始密码子抑制转录，但表面报告基因CD4仍然高表达水平的选择细胞会导致具有高度活性遗传位点的细胞积累。使用这些RMCE有效细胞系插入用于重组蛋白表达的转基因产生了用于SSI介导的CLD方法的高效CHO细胞。虽然使用慢病毒转导或替代起始密码子CTG的全局筛选方法的结果细胞系没有详细表征以了解SSR盒在宿主细胞基因组中插入的位置，但其他出版物利用了详细的测序方法来确定安全港。

1.3.转录热点在CHO细胞中位点特异性整合中的应用

因此，过去几年已经发布了几个热点，其中一些已被常规用于验证它们对SSI的潜力（表4）。CHO基因组背景中SSI最突出的位点代表次黄嘌磷酸核糖转移酶（Hprt1）基因，迄今为止，该基因已在五种不同的出版物中用作安全港。该基因位点的稳定性和转录活性已多次证实。有趣的是，Hprt1基因靶位点的效力与整合技术无关，并使用SSR以及转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）或成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）进行靶向。此外，fer-1样家族成员4（Fer1L4）基因和基因组位点A已成功且重复地靶向转基因表达。然而，许多其他靶向位点，如α-1,3-甘露糖基糖蛋白2-β-N-乙酰葡糖胺转移酶（Mgat1）、X射线修复交叉互补6（Xrcc6）或谷氨酸受体离子型红藻氨酸1（Grik1）已被利用，证明了SSI的各种潜在安全港。Zhaoetal.发表了SSR的一个有趣例子，他们用基因C12orf35将8号染色体的端粒区域作为避风港，从而产生高产CHO细胞。有趣的是，在之前的出版物中，8号染色体端粒区域的缺失被描述为导致高产的CHO细胞。因此，这些细胞的高表达水平可能是由于C12orf35基因的转录活性位点造成的，但也可能是由于8号染色体中端粒区域的靶向整合被破坏，或者甚至可能是两者的协同作用。

表4.在CHO细胞中利用重组酶或核酸酶的靶向整合方法总结

1.4.在CHO细胞系开发中实施位点特异性整合

如前所述，使用SSI有多种选择，例如HR、基于整合酶的SSR或通过核酸酶插入DSB以将基因插入到特定遗传位点。在CHO细胞中，主要利用整合酶和核酸酶通过在预定义的安全港中插入一个或少数情况下多个转基因拷贝来生成表达重组蛋白的细胞系。

1.4.1.CHO细胞中的酪氨酸重组酶家族

一个成熟的系统是Cre/loxP系统，到目前为止，已在5种不同的出版物中与CHO一起报道（表4）。因此，这些出版物中的每一个都涵盖了基于Cre/loxP的SSI的不同方面。例如，Obayashietal.开发了一种累积基因整合系统，以促进转基因盒在特定遗传位点中的重复整合。以这种方式，SSI和基因扩增相结合，克服了拷贝数少的限制。然而，最近的一篇出版物表明，如果在同一基因组点插入超过4到5个转基因拷贝，则会限制SSI与基因扩增方法相结合的效率，则mRNA和重组蛋白水平会出现平台期。在发明累积基因整合系统后，同一小组致力于研究突变的loxP位点，以提高SSR系统的整合效率，包括设计新的间隔序列。更高的效率显著提高了转基因整合后产生的克隆数量显著增加，减少了筛选多个克隆以鉴定有效生产克隆的需要。最后，该小组通过建立重复转染和整合系统为系统添加了另一项优化。对于突变的loxP位点和积累的基因整合系统，重复转染导致转基因在Hprt1基因所需表达位点的积累更高。该研究报告称，与基于SSI的单次转染CLD方法相比，scFv-Fc抗体的重组蛋白表达高出6倍。然而，由于这些系统依赖于将转基因整合到具有有限拷贝数的单个基因组位点中，因此比生产率仍然很低。为了解决这个问题，Sergeeva等人建立了一种具有双RMCE系统的细胞系，以便在独立的安全港中实现有针对性的多拷贝整合，以提高生产力。据报道，这再次导致了更高的比生产率，约为12-14pg/细胞/天，补料分批滴度接近1g/L。关于基于Cre/loxP的SSI的最新出版物侧重于通过使用双载体系统生成表达双特异性抗体的细胞系，方法是将这些载体以等量同时整合到相同的基因组位点中。因此，创建了一个具有两个不相容的loxP位点（L3和2L）的着陆垫，由第三个与相应载体的末端或开头相容的不相容的loxFAS位点隔开。一个载体包含L3兼容位点、一个启动子和一个起始密码子，用于适合loxFAS位点的选择标记，而另一个载体包含loxFAS位点、缺乏起始密码子的选择标记和2L兼容位点。使用这种创新解决方案，双特异性抗体的高表达达到每升数克。

CHO细胞中常见的另一种酪氨酸SSR是Flp-FRT系统。由于酪氨酸位点特异性整合酶之间只有微小的差异，因此两种系统在CHO细胞中都起作用也就不足为奇了。此外，关于Flp-FRT的出版物系列与使用Cre/loxP发表的研究高度重叠。虽然最初的出版物侧重于SSI的实施和一般功能，但后来的出版物试图优化Flp-FRT系统并在目标基因组环境中建立GoI扩增以改善重组蛋白表达。连续地，建立了多拷贝整合到一个基因组安全港中，最后，产生了具有多个独立SSR位点的宿主细胞系，用于同时共表达不同基因。至于Cre/loxP系统，含有缺乏起始密码子和启动子的选择标记的着陆垫是确保Flp-FRT系统正确整合表达盒的流行解决方案，用启动子和起始密码子ATG补充细胞系。

1.4.2.利用丝氨酸重组酶在CHO细胞中进行位点特异性整合

不太常见且最近才用于CHO细胞中SSI的是丝氨酸整合酶，如Bxb1。虽然2007年发表了CHO中重组蛋白表达的SSI的首次出版物，但直到第一项研究将酪氨酸与丝氨酸整合酶进行比较，才花了十年时间。Inniss等人能够证明Flp-FRT系统与Bxb1介导的SSR的可比性。有趣的是，尽管不同系统之间的滴度和时间表高度可比，但Bxb1介导的SSI导致更多的RMCE事件，这突出了这种整合酶作为以前占主导地位的SSI系统的替代品的潜力。在另一篇使用基于Bxb1的SSR的出版物中，生成了人工热点。第一步，将富含基质附着区域的着陆垫随机整合到宿主细胞基因组中，基于荧光的读数确定了最有前途的克隆。随着染色质结构通过富含基质附着区的着陆垫转化为更有利的环境，以实现稳定和增强的基因表达，这些宿主细胞可用于SSI和重组蛋白表达的第二步。这项技术导致重组蛋白的高表达，甚至能够同时整合多个载体以产生bsAb。尽管到目前为止，基于Bxb1的SSR仅展示了通过集成矩阵附着区域丰富的着陆点来生成人工热点，但我们假设此过程也适用于其他SSR方法。最后，丝氨酸SSR在结合CRISPR的混合方法中越来越受欢迎——精确整合到目标染色体（PITCh）和RMCE中。在这种情况下，CRISPR-PITCh用于在定义的SSI基因组位点中生成具有Bxb1兼容着陆垫的宿主细胞系。这种混合方法可以促进SSI兼容宿主细胞系的生成，特别是如果需要具有多个着陆垫的细胞系来表达越来越多的新兴复杂分子，这些分子依赖于多种不同的载体。

1.4.3.利用核酸酶在CHO细胞中的位点特异性整合的应用

尽管杂交系统可能有利于某些RMCE方法，但通过引入双链断裂也可以实现基于SSI的CLD，而无需将其与整合酶活性结合（图7）。核酸酶在SSI-CLD平台中起着重要作用，因为它们不依赖于以先前建立的着陆垫为先决条件的宿主细胞系。

图7.使用核酸酶进行位点特异性转基因整合，以生成高度均一的重组蛋白生成克隆，而无需生成新的宿主细胞系

可在预定义基因组位点进行双链断裂的核酸酶包括转录激活因子样效应核酸酶（TALENS）、锌指核酸酶（ZFN）和CRISPR-Cas9。通过核酸酶插入双机架断裂后，转基因可以利用专门设计的同源臂整合到所需的基因座。

虽然CRISPR-Cas9是SSI最常用的核酸酶，但一篇出版物测试了基于TALEN的GoI敲入。使用TALEN而不是CRISPR-Cas9的基本原理是可能会减少脱靶效应的数量。尽管研究人员原则上证明了TALEN介导的SSI的功能，但他们也观察到随机整合事件的频率很高，并且在多次优化后，所需基因组位点中只有少数正确整合的转基因。因此，必须投入大量的筛选工作来识别在所需安全港中具有转基因的克隆，这与基于SSI的CLD平台的预期减少筛选工作相矛盾，因为预计转染后会形成均匀的细胞池。同年，使用三个不同基因座在CHO细胞中验证CRISPR-PITCh系统，显示转基因成功整合，效率在7.4%-27.8%之间。因此，随后的出版物侧重于基于CRISPR的敲入的利用和优化。因此，遵循相同的原则，以几个着陆点为目标。选择合适的基因组热点后，将sgRNA、Cas9酶和带有转基因的供体DNA转染到细胞系中。核酸酶引入DSB，通过HDR将供体DNA的同源臂作为模板，将转基因引入所需的基因座。因此，C12orf35、Hprt基因、Hipp11基因和假attP位点在CHO细胞中成功用于生成表达重组的细胞系，然而，整合效率有限，约为10%。为了改进和建立一种工具来观察CRISPR-PITCh的整合效率，开发了一种称为位点特异性整合和基因组改变的报告系统。尽管该系统的缺点是宿主细胞系必须首先在特定基因组位点中为供体质粒生成一个着陆垫，但它能够定量SSI和RTI。因此，着陆垫控制超级折叠橙荧光蛋白（sfOrange）的表达，该荧光蛋白被SSI打断并导致供体质粒中缺乏启动子的青色荧光蛋白（CFP）的表达。如果没有SSI发生，则可以测量sfOrange但没有CFP表达，这暗示了SSI的效率。除了CFP，供体质粒还含有报告随机整合量的RFP蛋白。最后，通过计算sfOrange、CFP和RFP阳性细胞系之间的比率，可以定义SSI和RI效率并用于所需表型的FACS富集。借助该系统，Hamaker及其同事能够将转染效率提高多达20倍，从而显著减少筛选工作。另一种提高SSI效率的替代方案是敲除DNA连接酶IV。有趣的是，这种缺失不仅将SSI效率提高了约9倍，而且还减少了RI事件，显着突出了细胞工程方法是改进CRISPR-PITCh系统的有前途的解决方案。

总之，基于SSI的CLD方法具有巨大的潜力，可以通过确保同质整合到预定义的基因组热点中来缩短细胞系开发时间和筛选工作。然而，大多数使用SSI的已发表研究仍然难以应对整合效率有限、不良脱靶效应或拷贝数过低等问题，这与所使用的整合平台无关。此外，到目前为止还没有发表的研究，进行全面比较以调查整合位点对不同启动子或替代转基因的影响和灵活性。尽管基于核酸酶和整合酶的系统都取得了实质性的改进，但仍需要进一步的开发活动。在大多数情况下，低滴度通常会阻碍SSI系统在工业CLD平台中的实施。此外，依赖于多载体平台的日益复杂的分子对SSI系统提出了挑战，因为对于大多数SSI程序，必须建立具有预定义着陆垫的宿主细胞系，这需要大量的经济和费力工作。尽管如此，与现有技术的改进和潜在组合可能会进一步促进SSI在工业CLD平台中的实施，以最大限度地提高开发活动的速度和稳健性。

2.结论

几十年来，随机转基因整合一直是将重组DNA稳定引入CHO宿主细胞系以生成工业生产细胞系的主要方法。表型和遗传稳定且高产的细胞系是治疗性糖蛋白高效生产过程的基础，因为细胞工厂决定了生物制药产品的命运。换句话说，与生产细胞系相关的问题最终会分别对整个制造过程和产品构成风险。随机转基因整合具有固有的局限性，例如表达载体在宿主细胞基因组中频繁出现串联结构，这可能导致基因组不稳定或沉默现象。此外，基因组整合的载体片段（分离或与表达盒的其他部分共整合）导致非或低产细胞群，与表达完整产物的细胞相比，翻译负担更少，因此通常生长较慢。因此，由于低产细胞的过度代表，散装细胞池通常在选择过程后表现出非常低的生产率，因此鉴定高产克隆细胞系需要大量的筛选工作。最后，不幸的是，通过随机转基因整合产生的高产克隆通常被证明是表型不稳定或遗传不稳定的（或两者兼而有之），因此仅在CLD过程的最后才被取消选择。

鉴于最近建立的（半）靶向整合技术的巨大潜力，很明显，自首次推出以来的过去四十年中，CHO细胞系的全部潜力被低估了。鉴于随机转基因整合作为生成稳定CHO生产细胞系的主要方法的历史普遍性，值得质疑更广泛的生物制药界延迟采用（半）靶向整合技术的原因。虽然关于重组酶和转座酶介导的转基因整合成工应用的首次报道分别可以追溯到2009年和2011年，但该行业内的实施仅在几年前才开始。一种可能的解释可能是制药行业普遍保守，即在排除这些新技术与现有方法的任何潜在劣势之前直接实施尖端技术。毫无疑问，在过去几年中，CLD领域发生了翻天覆地的变化，（半）靶向整合技术可能会成为CHO细胞系开发的主要选择。这最终可能会产生更表型和遗传稳定性以及高性能的生产细胞系，从而在未来导致更稳健的生物制药制造工艺。

3.未来前景

（半）目标整合技术的实施将对未来CLD流程的有效性产生重大影响。然而，尽管先进的转基因整合技术会提高池和克隆的产量，但筛选可能仍然是确定最有前途的克隆的重要因素。为了进一步促进这一发展，研究人员已经开始结合最新的基因组工程技术来构建更有效的遗传工具。其中一种方法涉及（失活的）Cas9核酸酶与转座酶的融合，以允许转座酶的靶向方向到宿主细胞基因组中非常特定的位点。与传统的CRISPR/Cas介导的敲入策略相比，RNA引导的Cas酶的位点特异性与转座酶的高效“剪切和粘贴”功能相结合可能会导致更高的基因整合频率，这些策略依赖于细胞的相对低效的同源依赖性修复（HDR）机制，因此可能会显着改善此类应用。最后，考虑到表达稳定性的大幅提高，稳定库作为细胞基质也将变得更具吸引力，以实现高度创新疗法的快速临床试验。成功完成的抗SARS-CoV-2中和单克隆抗体疗法的药物开发项目至少证明了基于稳定池的药物生产方法的巨大潜力。事后看来，技术经常战胜既定方法，因此，如果基础数据证明这种方法是合理的，卫生当局可能会在未来重新考虑立场，以造福患者。

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