摘要： 寡核苷酸合成是现代生命科学的基石，在分子诊断、治疗开发和变革性技术（包括 DNA 数据存储和可编程生物系统）方面取得了突破性进展。虽然基于亚磷酰胺的化 学合成仍然是工业标准，但其在生产长序列构建体方面的局限性、累积错误率和对有毒溶剂的依赖对下一代应用构成了重大挑战。新兴的酶促合成方法通过利用生物系统固有的精度和环境可持续性提供了范式转变。

本综述系统地研究了寡核苷酸合成技术不断发展的前景。我们首先分析了传统化学方法的机制基础和持续局限性，然后对酶促策略进行了批判性评估，特别强调末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的不依赖模板的聚合。这项工作提供了对酶促反应工程的详细见解，包括核苷酸类似物的底物特异性分析和支持迭代核苷酸添加的创新固相合成平台。此外，我们还讨论了新兴的高通量合成架构和商业翻译工作。综上所述，本文全面概括了酶促合成技术的进展和商业化现状，为加快酶促寡核苷酸生产平台的创新发展提供了有价值的指导。

【NO.1】引言

本综述全面分析了从头酶寡核苷酸合成的最新进展。为了便于对酶法技术进行全面检查，本文探讨了传统化学合成方法的历史背景和固有局限性。从战略合成的角度来看，该综述总结了酶促寡核苷酸合成的现状，强调了影响合成过程质量和可控性的关键因素。具体来说，它研究了末端脱氧核苷酸转移酶的关键作用，以及这些过程中使用的化学底物。此外，还探讨了酶法固相合成的原理和最新进展。除了酶促DNA合成之外，该综述还讨论了RNA和修饰寡核苷酸的酶促生产。最后，它考虑了这个快速发展的领域的高通量合成、商业化和未来研究方向的前景。

【NO.2】从头寡核苷酸合成的发展历史

2.1从头寡核苷酸合成的简史和现状（图1）

2.2.从头酶寡核苷酸合成方法的发展

迄今为止，酶促寡核苷酸合成现在包括多种方法，通常使用PNP酶、T4RNA连接酶和TdT等酶。然而，由于合成效率低、纯化困难和对特异性引发剂的强烈偏好，涉及T4RNA连接酶和PNPase的方法面临挑战。因此，基于TdT的合成方法逐渐成为该领域的主要方法。

一般来说，根据对模板的需求，酶促DNA合成技术大致可分为两类：模板非依赖性和模板依赖性方法。不依赖模板的方法主要利用TdT，不需要预先合成的模板，允许任意合成所需的序列。然而，使用这种方法实现受控、精确和高效的合成需要在TdT修饰、底物选择和合成工艺设计方面取得重大进展。相反，最近的发展引入了不依赖于TdT的模板依赖性酶合成方法。这些方法采用聚合酶，如9°N和KOD，它们通过瞬时配对或形成自引发发夹来扩展序列。通过模拟天然DNA复制过程，这些方法虽然需要预先合成的模板，但为提高合成效率、大规模生产和制备修饰的寡核苷酸提供了巨大的潜力。

【NO.3】通过不依赖模板的方法酶促合成DNA寡核苷酸

TdT在寡核苷酸的模板非依赖性合成中起着不可或缺的作用。这种酶独特地促进了DNA链3'端四种不同核苷酸（A、T、C、G）的随机聚合，允许链的延伸可能达到数千个核苷酸的长度。然而，这种自然延伸过程往往不受控制，无需任何干预。实现精确高效的寡核苷酸合成对于更广泛地采用酶法至关重要，尤其是在高精度应用中。通常，该工艺采用改性的TdT来精确连接引发剂和底物，确保无缝和高效的偶联反应。深入了解TdT的来源、表达、结构信息和催化机制对于使用该酶实现更高的催化效率至关重要。此外，底物纯度和脱保护反应效率等因素会显著影响合成的准确性和质量。本节将讨论与不依赖模板的合成相关的方面，重点介绍TdT的受控合成方法、底物选择、潜在机制的阐明以及合成过程的优化。

3.1.TdT的来源和异源表达

来自不同来源的TdT酶的催化活性、底物特异性、稳定性和表达水平可能有所不同，所有这些都对寡核苷酸合成有重大影响。最近的一项研究报告了来自不同来源的9个TdT序列。TdT变体的稀缺性限制了我们对TdT家族内酶多样性的理解，并限制了TdT在生物合成应用中的选择。因此，迫切需要鉴定具有优异生化性质的新型TdT变体，例如增强的聚合和水解活性以及改进的底物特异性。

除了TdT的来源外，了解可溶性表达模式对于其在寡核苷酸合成中的应用至关重要。已经表明，TdT在工程细菌中的表达通常很低，不足以满足应用需求。这可能归因于脊椎动物的TdT基因起源以及该蛋白质的高分子量，约为70kD。在早期研究中，TdT蛋白是从牛胸腺组织中提取的，或从急性淋巴细胞白血病患者的细胞中培养的。Chang等人报道了一种用于人TdT的杆状病毒过表达系统，其表达水平比以前的方法高200倍。随后的研究探索了增强工程细菌中TdT可溶性表达的各种策略。例如，研究人员通过降低培养温度和过表达稀有精氨酸tRNA，将大肠杆菌中MuTdT（来自小鼠）的表达水平提高了三倍。同样，通过序列截断，大肠杆菌中BoTdT（来自牛胸腺提取物）的表达提高了20-30倍。我们的初步研究表明，使用基于三维结构建模截断BRCT结构域、向N末端序列添加GST或SUMO增溶剂标签以及优化发酵培养基以部分表达TdT基因等策略，成功表达了几个新发现的TdT基因。尽管有一些成功的策略，但实现TdT的可溶性表达仍然是寡核苷酸合成中的重大挑战。

3.2.利用TdT合成寡核苷酸的策略

为了实现受控合成，已经开发了各种策略来确保精确添加。TdT依赖性酶合成大致可分为三种方法：3′终止、TdT-dNTP偶联物和无终止子方法（图1b、图2）。其中，3'端接方法尤为突出。如图2a所示，dNTP底物的3′-羟基（3′-OH）基团受到可逆终止剂（RT）的保护。为了实现单碱基延伸，在工程化TdT酶的催化下，将封闭的dNTP添加到引发剂的3'端。然后，RT被裂解，释放引发剂的3′-OH用于下一个延伸周期。由于TdT的天然结构，需要进行修饰以适应增加的空间位阻并与3′-OH以外的基团相互作用，以确保有效的核苷酸附着。TdT的修饰及其催化机制将在后续部分中详细讨论。具有3'终止基团的底物将在讨论TdT之后单独介绍。

图2.TdT的寡核苷酸合成策略

3.3.TdT的结构信息和催化机理

根据序列相似性，TdT与polβ、polλ和polμ一起被归类为DNA聚合酶polX家族。TdT的第一个晶体结构（MuTdT，PDBnumber：4qz9）于2002年被阐明。该结构表明其催化结构域与polX家族的催化结构域一致，包括finger、palm、thumb和8-kDa结构域（图3）。这四个结构域在TdT中形成隧道状催化活性中心，另一个BRCT结构域位于N端，与催化中心分开。虽然BRCT结构域不直接促进无模板DNA聚合，但它在捕获双链DNA中起着至关重要的作用，并且对于非同源末端连接很重要。与polX家族中的其他DNA聚合酶不同，TdT在其活性中心内具有长环结构（图3b，环1），据推测，这对其不依赖模板的DNA聚合活性至关重要。此外，研究人员已经解析了MuTdT的“蛋白质和底物”复杂结构，证明寡核苷酸（作为受体底物）和dNTP（作为供体底物）同时在MuTdT的隧道状催化中心结合。寡核苷酸的3′-末端二核苷酸与−1和−2位点结合，而dNTP与+1位点结合。氨基酸残基L398和F405与寡核苷酸的3′-末端核苷酸形成楔形结构，促进核苷酸在+1和−1位点堆积，从而稳定反应过程中的聚合构象。

图3.TdT的结构域和三维结构（PDBID4qz9）

在TdT的3'末端合成策略（图2a）中，使用了在3'末端经过修饰（可逆终止子）的非天然核苷酸，在核苷酸单体和+1位点之间产生显着的空间位阻。因此，天然TdT对非天然核苷酸底物的聚合活性降低，需要通过蛋白质修饰在+1位点扩展活性腔以增强TdT的聚合活性。研究人员已经探索了各种蛋白质修饰方法来提高TdT对非天然核苷酸的活性，包括改变dNTP三磷酸基团附近的氨基酸残基以调节其自由度，调整碱基附近的残基以影响碱基堆积，以及修改寡核苷酸的结合途径以增加底物亲和力。这些修饰的灵感来自对TdT三维结构的更深入理解，特别是TdT在其活性中心结合非天然dNTP的结构信息。然而，迄今为止，仅分析了MuTdT的结构信息，而+1位点与受保护的非天然核苷酸组之间的相互作用仍未被探索，严重阻碍了TdT催化机制和功能修饰的分析。

“TdT&oligo”复合物的三维结构揭示了供体底物结合位点主要与寡核苷酸的3′-末端四核苷酸相互作用，特别是最后两个核苷酸。结果表明，TdT对具有不同3′-末端二核苷酸的寡核苷酸表现出选择性，这些二核苷酸由四个核苷酸的成对组合形成。在3'-末端二核苷酸上具有“CT”、“CA”和“TC”的寡核苷酸在反应过程中被认为是较弱的供体底物。TdT对四个核苷酸的受体偏好在很大程度上受+1位点氨基酸残基与核苷酸碱基之间的极性相互作用和空间位阻的影响。最近的报告表明，ZaTdT对嘧啶碱基的受体偏好大于嘌呤碱基，这可能是由于嘧啶基团在+1位点的空间位阻较小。不同底物的转化率可能会有很大差异，表现出较差偏好的底物会降低整体聚合反应速率。

除了无模板的DNA聚合活性外，TdT还在寡核苷酸的3′-末端具有核酸外切酶活性（水解和焦磷酸分解）。这些核酸外切酶活性理论上将底物转化率限制在100%以下，水解和焦磷酸分解会导致合成错误，例如碱基缺失和插入最终寡核苷酸产物，从而降低合成准确性。实验证据表明，在存在大量核苷酸单体的情况下，水解活性受到显着抑制，并且从系统中去除焦磷酸盐后，焦磷酸分解活性停止。

polX家族的DNA聚合酶通过“双金属离子机制”（图4）促进聚合反应。在这个过程中，位置1的金属离子（M1）与寡核苷酸的3'末端配位，而位置2的金属离子（M2）与dNTP的三磷酸基团螯合。在反应过程中，M1与寡核苷酸的3′-末端羟基配位，形成高度亲核的醇氧离子，然后攻击M2-dNTP螯合物的α-磷酸盐，导致形成新的磷酸二酯键并释放二磷酸盐。这种双金属离子机制依赖于二价金属阳离子，例如Co2+锌2+毫克2+和Mn2+，它们充当金属活化剂以促进聚合反应（表1）。研究表明，包括Co2+或Zn2+在TdT反应系统中显着增强酶对寡核苷酸的亲和力，从而显着提高聚合速率。此外，Co2+据报道，可有效提高工程化TdT酶添加修饰核苷酸的催化效率。此外，Mg的联合使用2+和Zn2+已被证明可以将TdT的聚合活性提高2到4倍。锰2+还通过稳定酶-DNA复合物和促进进行性伸长来促进TdT活性。此外，二价金属离子可以优化TdT的衬底偏好。例如，添加Mg2+有利于dGTP和dATP的聚合，而Co2+更有利于dCTP和dTTP的聚合。相反，高浓度的一价阳离子，如K、Na和NH₄，会抑制TdT的聚合活性。

图4.TdT的双金属离子催化机理示意图（PDBID4qz9），说明了金属离子、寡核苷酸和dNTP之间的相互作用结构。

表1.金属离子对TdT聚合活性的影响总结

3.4.酶促寡核苷酸合成中的可逆终止子

在3′终止策略中，采用可逆终止子对于实现受控和精确的逐步核苷酸掺入至关重要。有效的可逆终止剂应具有几个关键特性：（i）它必须阻断核苷酸的3′-OH末端以防止进一步延伸直至去除，（ii）它应该被聚合酶有效掺入而不会妨碍其活性（iii）它在储存和合成过程中必须保持稳定以防止水解降解，以及（iv）它应该在温和的条件下易于去除，不会损坏核苷酸或生长中的寡核苷酸链。这些原则对于下一代测序（NGS）也至关重要，其中准确的DNA碱基添加至关重要。测序化学的发展引入了各种终止子基团，包括3′-O-叠氮甲基、3′-O-烯丙基和3′-ONH2是最常用的。值得注意的是，这些终止子在酶促寡核苷酸合成中也很受欢迎，突出了它们的多功能性和有效性。

图5.用于酶DNA寡核苷酸合成的可逆终止子

图6.a.3′-O-叠氮甲基化物的脱保护机制

3.5.影响酶促合成寡核苷酸质量的因素

酶促合成寡核苷酸的质量可能会受到底物缺陷和合成过程中各种因素的影响。

本文将简要研究酶促合成中三种常见合成错误的潜在原因：插入、缺失和取代。插入错误主要归因于未受保护的3′-OHdNTP的存在，这是由于底物纯度不佳或3′-OH保护基团不稳定造成的。这是因为未受保护的dNTP可以有效地参与酶催化的偶联反应，从而在单个循环中添加多个碱基。同样，缺失错误可能由三种情况引起：（i）酶催化偶联效率低下导致寡核苷酸延伸不完全，（ii）脱保护步骤不完全导致3′-O末端受阻，从而阻止正常偶联，以及（iii）TdT的核酸外切酶活性，它水解寡核苷酸末端的磷酸二酯键。取代错误通常是由不完全洗涤和试剂引入的碱基突变引起的。首先，先前循环中残留试剂的去除不充分会影响当前合成的纯度，这凸显了彻底洗涤步骤的重要性。其次，脱保护步骤中使用的试剂可能存在碱脱氨的风险。建立温和高效的脱保护条件对于防止取代错误和提高合成质量至关重要，但它经常被忽视。

【NO.4】通过模板依赖性方法酶促合成DNA

图7.两种模板依赖性酶寡核苷酸合成策略

这两种依赖于模板的酶合成方法都需要模板的预合成。但是，由于它们与模板的交互方式不同，因此每种方法都侧重于不同的优势。第一种方法旨在通过瞬时配对提高合成的灵活性，从而允许预先设计的模板适应所有四个碱基的扩展，同时保持模板依赖性合成的快速效率。相比之下，后一种方法承认模板的局限性，并专注于开发高效的大规模合成。

【NO.5】RNA、XNA和其他修饰寡核苷酸的酶促合成

自2016年以来，FDA和EMA每年大约批准两种寡核苷酸药品，包括反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）。目前基于RNA的疗法的化学合成方法存在纯度限制，通常约为90%。此外，硫代磷酸酯修饰的序列通常包含复杂的异构体杂质。这些挑战，加上对基于核酸的药物和疫苗的需求不断增长，凸显了为RNA、异种核酸（XNA）（如图8a所示）和其他修饰寡核苷酸开发新的酶合成方法的重要性。

图8.a.本综述中提到的RNA（a.i）、修饰的RNA/DNA（a.ii，a.iii，a.iv）和XNA（a.v，a.vi，a.vii）的三磷酸单体的结构。b.用于酶促RNA和XNA寡核苷酸合成的可逆终止子

2024年，Wiegand等人利用CID1poly（U）聚合酶（PUP）的突变变体，推出了一种创新的RNA寡核苷酸模板非依赖性酶合成平台。该方法采用可逆终止策略，通过保护3′-OH基团而不保护2′-OH基团来精确控制RNA序列合成。在他们的研究中，使用了三个不同的可逆终止组。3′-O-烯丙基终止基团（图8bi）可有效合成2′-未修饰和2′-修饰的核糖核苷酸，例如2′-OMe（图8aii）和2′-F（图8aiii）。此外，成功掺入了具有3′-O-炔丙基的底物（图8bii），为用于RNA药物递送的GalNAc等官能团提供了多功能偶联位点。对于涉及硫代磷酸酯主链的修饰，使用3′-O-叠氮甲基基团（图5ii）来解决P-S键在Pd催化剂条件下的不稳定性。该方法在液相和固相中进一步验证，分别合成了10个和5个核苷酸的未修饰RNA序列，平均偶联效率为95%。对于修饰的RNA寡核苷酸，该团队在两个阶段都成功合成了2'-F和2'-OMe修饰序列，证明了这种酶促RNA合成方法在治疗性寡核苷酸制造中的潜力。该技术消除了传统化学合成方法中保护2′-OH和核苷酸碱基上基团所需的常规切割步骤，降低了脆弱的RNA寡核苷酸链受损的风险。

除了上述不依赖模板的3'-OH保护策略外，顺式-2'，3'-二醇保护（图8biii、iv）也是酶促RNA合成的替代方法，具有防止2'-5'-分支RNA形成的优势。Hollenstein的小组已经开发了各种顺式二醇保护基团。值得注意的是，2'，3'-O-异亚丙基（图8biii）封闭的嘧啶核苷酸被野生型PUP有效催化加成，在5分钟反应期内达到95%的偶联效率。这种方法的一个潜在局限性是阻断2′-OH限制了2′-修饰的可能性，这通常是治疗应用所必需的。

在前面提到的模板依赖性酶寡核苷酸合成方法的基础上，Moody小组进一步推进了这种方法，以合成具有各种修饰的序列，包括2'-OMe、2'-F、Rp/Sp-PS、Rp/Sp-2′-F-PS和LNA。通过使用聚合酶KOD、TfPol⁎、DPO4⁎和KODDGLINK公司，他们成功制备了几种临床相关的寡核苷酸，包括pegaptanib、fomivirsen、alicaforsen、trabedersen和aganirsen。值得注意的是，反义抗病毒药物福米韦森被合成为全Rp纯度为87%的单一立体异构体，产量为0.73mg。

异种核酸（XNA）（图8av、vi、vii）为与天然DNA和RNA相关的一些限制提供了有前途的解决方案。通过提高稳定性、提供新的结构基序和增强靶标结合，XNA在治疗性寡核苷酸的开发中具有巨大潜力。在结构上，它们与典型的DNA和RNA不同，主要在于它们的骨架，最明显的是糖部分。几个研究小组已经涉足这个利基领域。锁定核酸（LNA）的酶促合成（图8av）、苏糖核酸（TNA）（图8avi）和己糖醇核酸（HNA）（图8avii）已有报道。与DNA和RNA合成方法类似，可逆终止剂（磷酸盐、酯（图8bv）、醚）和工程化TdT/PUP聚合酶也用于酶促XNA合成。

除了广泛研究的聚合酶外，聚合酶类型的多样性还为寡核苷酸合成提供了许多创新方法。例如，Taq和Klenow（exo−）聚合酶已被用于催化三核苷酸三磷酸（dN3TPs）用于合成XNA和修饰的寡核苷酸。此外，聚合酶如KODXL、Vent（exo−）、Bst大片段、Bst2.0和Bst3.0已用于碱基修饰寡核苷酸的合成。这些进步突出了各种聚合酶在扩展寡核苷酸合成能力方面的潜力。

在对基于聚合酶的合成方法进行广泛讨论之后，最近的进展也突出了基于连接酶的酶合成方法的发展。研究人员主要专注于开发RNA合成方法、XNA和修饰的DNA，而不是传统的寡核苷酸。通常，连接酶催化5′-磷酸基团和3′-OH基团之间磷酸二酯键的形成，以模板依赖性方式将短核苷酸片段连接成较长的序列。由于连接酶对核苷酸结构修饰的高耐受性和互补配对的要求，这种合成方法在降低合成错误率和通过连续修饰产生更长的寡核苷酸方面具有优势。

【NO.6】酶寡核苷酸合成中的固相合成方法

为了实现核苷酸的连续添加以合成一定长度的寡核苷酸，有必要采用固相寡核苷酸合成（SPOS）方法进行连续和大规模生产。固相合成策略最初是为肽合成而开发的，随后扩展到其他线性大分子，包括DNA和RNA。在酶促SPOS工艺中，必须仔细考虑几个关键因素（图9）：固体支持物的选择（图9a）、引发剂的固定化（图9b）和合成寡核苷酸的切割（图9d）。下面将详细讨论这些因素中的每一个。

图9.寡核苷酸从头酶促合成的示意图

6.1.寡核苷酸合成的固体支持

自1980年代以来，已经开发了多种支持材料来满足各种化学寡核苷酸合成要求（表2）。在酶促SPOS中，引发剂必须牢固地连接到支撑表面。因此，选择合适的固体载体至关重要，它会影响偶联效率、产物纯度和整体合成规模。目前，一些酶促合成研究使用磁珠作为概念验证的固相支持物。然而，磁珠的聚集会在合成过程中引入错误，与稳定性或成本相关的问题使其不适合大规模应用。2024年，韦根展示了使用LCAA（长链烷基胺）-CPG合成RNA寡核苷酸，实现了五个碱基的连续延伸。这标志着CPG在酶促合成中的应用首次被报道。在Yin等人最近关于超长寡核苷酸链化学合成的工作中，使用玻璃棉和玻璃珠等更光滑的表面代替传统的多孔载体，导致合成错误率降低了10倍。这一发现不仅为酶促合成提供了有价值的见解，还强调了优化和选择固体支持物对合成寡核苷酸质量的关键影响。研究人员正在积极寻求高通量平行酶合成。例如，Verardo展示了使用叠氮化物修饰的载玻片作为其注射平台的固体载体的多重酶DNA合成。

2022年，Jung等人使用CMOS作为载体，对受3′-氨基氧基保护的寡核苷酸和单核苷酸延伸进行空间选择性解阻。同样，CMOS芯片是Smith等人提出的平行DNA合成方法的组成部分，该方法将电化学与TdT-dNTP偶联物酶促DNA合成相结合。预计几乎所有用于化学寡核苷酸合成的支持物都可以适用于酶固相合成，具体取决于合成系统设计和寡核苷酸的预期应用。然而，选择理想的固体载体涉及几个关键考虑因素，包括其表面是否存在适当的化学基团、材料成本以及稳定性、可扩展性和与酶工艺的兼容性等因素。

表2.寡核苷酸合成中使用的支持体比较

6.2.引发剂的固定

固相亚磷酰胺法和固相酶法之间的一个关键区别是引发链的固定化。在酶促合成中，引发剂必须牢固地锚定在表面，以作为酶的结合位点（图9b）。相比之下，化学方法通常涉及将表面与合适的接头臂偶联以启动核苷酸延伸。已经开发了各种方法将单链引发剂连接到支撑表面。例如，ANSA Biotechnologies和Microsoft Research证明了用3-（缩水甘油氧丙基）三甲氧基硅烷对微阵列表面进行硅烷化以引入环氧化物基团，然后通过酸催化的亲核加成与3′-末端胺官能化的单链寡核苷酸偶联（图9bi）的在Wiegand的酶固相RNA合成中，使用NHS偶联化学将5'-胺引发剂标记到Bis（NHS）PEG5接头修饰的LCAA-CPG上（图9bii）。同样，几种DNA测序方法采用表面胺化或炔基化（图9biii），然后与3'修饰的寡核苷酸链连接。点击化学提供了另一种将引发剂共价连接到表面的有效方法。DNA Script展示了他们的平行合成系统，该系统使用无铜点击SPAAC（菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应）将DBCO修饰的寡核苷酸与叠氮化物修饰的玻璃衬底相结合（图9biv）。此外，除了确保稳定的起始剂固定化外，优化这些固定起始剂的空间排列在酶促合成中也至关重要。酶比典型的化学分子要大得多，并且需要更多的空间来延长链。如果引发剂堆积太密集，合成效率可能会降低，而过于稀疏的排列可能会对整体合成产量产生负面影响。

6.3.合成寡核苷酸的切割

与固相亚磷酰胺化学中用于释放寡核苷酸链的氢氧化铵诱导方法相比，酶促合成偏爱非化学方法，以满足其对温和、无毒和环保条件的需求。两种酶切割方法最常报道：尿嘧啶（dU）位点的USER酶切割和肌苷（dI）位点的核酸内切酶V切割。值得注意的是，核酸内切酶V将第二个磷酸二酯键3′裂解到修饰的dI位点，而USER酶去除U碱基，形成1核苷酸间隙并留下末端磷酸基团。与USER-dU切割位点相比，核酸内切酶V-dI位点的切割方法可能具有可重复使用的优势。这种方法避免了每个合成的寡核苷酸都需要对应于引发剂上的唯一切割位点，从而可能允许重复使用固定在固体支持物上的引发剂。在寡核苷酸中重置的光可切割基团的紫外线切割提供了另一种可行的解决方案，如DNAScript的平行合成文章所示。使用UV切割时，平衡效率和碱基损伤至关重要，因为过强的UV强度会损坏碱基，而强度不足可能会导致切割不完全或效率低下。

在酶合成的当前阶段，科学家们将大部分精力投入到研究和开发酶、底物和合成过程上。尽管存在一些案例研究，但缺乏对酶促SPOS的针对性研究。然而，SPOS可能成为未来酶促合成方法中的限速步骤。

【NO.7】酶DNA/RNA寡核苷酸合成的高通量合成和新兴商业技术

关于酶促寡核苷酸合成的讨论主要集中在+1和+N合成的原理上。然而，实现高通量酶合成仍然需要自动化技术来减少体力劳动并提高整体效率。目前，已有几家公司进入市场，将酶促DNA/RNA合成商业化（表3），并在高通量酶合成方面取得了重大进展。这些公司中的大多数采用涉及TdT的策略，而少数公司则探索其他酶方法。

表3.应用酶DNA/RNA合成方法的公司摘要

7.1.酶促DNA寡核苷酸合成的商业技术

TdT-3′-O终止策略被从事酶DNA寡核苷酸合成的公司广泛采用。值得注意的是，DNAScript被公认为该领域的领导者。2020年，他们推出了SYNTAX，这是世界上第一台基于酶的自动化台式DNA打印机，允许研究人员在自己的实验室中按需合成DNA。根据DNAScript的网站，SYNTAX平台支持的最大合成长度为120个核苷酸，通量高达96，每次运行每个寡核苷酸的产量为550pmol。此外，他们还提出了一种将喷墨打印技术与TdT-3′-O终止策略相结合进行多重合成的新方法。这种方法使用四个硅MEMS压电喷墨打印头沉积皮升体积的墨水以进行酶促DNA合成，对单核苷酸添加进行两步偶联和脱保护反应。随着打印精度和芯片位点密度的进步，该方法可能会在未来显著提高酶促合成的通量。Molecular Assemblies（现在是TriLinkBioTechnologies的一部分）与Codexis合作，通过定向进化推进了野生型TdT，修饰了其超过25%的氨基酸以优化其酶促DNA合成。他们的全酶合成（FES）技术能够在皮摩尔或飞摩尔尺度上生产长达400个核苷酸的长、高保真寡核苷酸，具有惊人的99.9%的逐步掺入效率。这项创新技术在所有合成步骤中均采用酶催化工艺，包括脱保护，显著减少DNA损伤并最大限度地减少有毒试剂的使用。

2024年，他们报告在不到5天的时间内合成了纯度为90%的450聚体。中和基因科技开发了一种酶促探针合成仪。正如他们的官方网站所描述的，该产品是将酶促DNA合成过程与喷墨打印和微流控芯片技术相结合的桌面短链DNA合成仪。2024年，他们推出了一个名为DNA-DISK的创新平台，该平台将酶促DNA合成与数据存储集成在一起。他们的合成策略在由工程化TdT（E-ZaTdT）介导的八个寡核苷酸中实现了97.67%的平均逐步产量。此外，它们采用生物加帽步骤来防止非特异性延伸并确保序列特异性，类似于亚磷酰胺化学中的乙酰化加帽步骤。尽管额外的步骤可以提高最终产品的纯度，但它们不可避免地会增加合成时间和成本。

Ansa Biotechnologies采用独特的TdT-dNTP偶联物策略，与其他公司不同。2023年，他们宣布成功从头合成世界上最长的DNA寡核苷酸，使用他们的TdT-dNTP偶联物方法实现了长达1005个核苷酸的长度。值得注意的是，28%的合成产品是全长，表明在整个合成过程中平均逐步产率约为99.9%，处于行业领先地位。同年，Ansa通过在微电极阵列上通过电化学氧化裂解偶联物，将他们的TdT-dNTP偶联物方法与电化学技术相结合。这代表着向高通量自动化酶促寡核苷酸合成迈出了重要一步。2024年初，他们宣布能够提供多达600个碱基对的未组装DNA序列，即使具有极端的GC含量、串联重复序列和二级结构。

Kern Systems是DNA数据存储的先驱，采用无终止子策略来合成编码用户定义内容的DNA链。如前所述，Kern Systems使用天然TdT和具有游离3′-OH基团的核苷三磷酸盐。尽管这种策略并不能完全防止相同碱基的过度扩展，但后续的编解码器进程可以从不完美合成的链中检索数据，从而实现准确的信息编码。

除了主流的TdT依赖策略外，一些初创公司还采用了酶促寡核苷酸合成的替代方法。Camena Bioscience成立于2016年，开发了gSynth®平台，该平台避免使用TdT，转而采用一种新颖的方法。根据他们的网站，gSynth®平台能够产生任何长度和复杂性的DNA序列。该平台利用三核苷酸作为构建块，通过专有的酶组合偶联，以实现高准确度和更长的序列长度。早在2019年，Camena就宣布生产2.7kb质粒并合成300个核苷酸片段，总产量为85.3%。

7.2.酶促RNA寡核苷酸合成的商业技术

除了专注于酶DNA合成的公司外，还有几家企业致力于酶促RNA合成。Codexis的ECO合成™技术因其能够通过使用工程化TdT掺入2'修饰的核苷酸和骨架修饰的α-硫代磷酸酯核苷酸而著称。在整个合成过程中，3′-封闭-2′修饰的NTP被用作单体，随后通过酶机制裂解封闭基团。EnPlus One Biosciences是酶促RNA合成领域的先驱公司。他们创新的水基ezRNA™平台有助于RNA寡核苷酸的合成，而无需化学方法中必不可少的2′-O保护基团。该平台可以以适合RNA治疗应用的规模合成修饰的RNA序列。2024年，该公司在一篇开创性的论文中公布了他们的技术。

7.3.影响酶寡核苷酸合成商业化的因素

在酶促寡核苷酸合成的当前阶段，有几个因素会影响其进一步的商业化，包括合成长度和准确性的提高、通量的扩大、作可行性和成本控制。

长度和准确度与合成效率密切相关。大多数DNA合成公司目前实现的合成长度通常不超过400个核苷酸。从这些合成长度可以推断出，目前酶合成方法的逐步效率极限约为99.8%至99.9%。有几个因素导致了实现近乎完美的合成效率的挑战：（i）酶和改性底物之间的相容性不理想，（ii）无法获得完整的底物纯度，以及（iii）与固相载体上的长链相关的空间位阻问题。此外，随着寡核苷酸长度的增加，二级结构（例如发夹或茎环）形成的可能性也会增加，这会阻碍聚合酶的结合和延伸。这个问题可能通过加热、微波处理或添加变性剂等方法得到缓解。在准确性方面，合成过程中残留试剂的去除和洗涤具有重大影响。与化学试剂相比，酶更容易吸附到寡核苷酸和固相载体上，从而影响后续合成步骤。

扩大合成通量是开发酶合成技术公司的一个关键重点。高通量化学合成方法的许多原理可以适用于酶促合成。然而，由于试剂性质（如粘度、密度和浓度）的差异，需要付出大量努力来调整设备和方法以提高合成通量。

在评估合成方法的作可行性时，重要的是要考虑试剂的储存要求。在多个合成周期中，化学合成中使用的试剂通常在室温下储存，而酶试剂通常需要低温储存以防止灭活。这需要带有制冷模块的合成设备来满足这些低温储存要求。提高酶的热稳定性可以通过提高酶在室温下的稳定性来潜在地解决这种不便。另一个值得注意的一点是，化学合成通常需要严格控制水分和空气，以确保合成效率并最大限度地减少副反应。这包括使用干燥溶剂和惰性气体保护，这可能会带来作挑战和额外成本。相比之下，酶合成中使用的水性体系在这方面可能具有显著优势。

在合成成本方面，化学和酶促合成中使用的底物（亚磷酰胺单体与3′-O修饰核苷酸）对这两种方法的成本有显著影响。众所周知，3′-O修饰的核苷酸通常比亚磷酰胺单体贵10到100倍。然而，化学合成通常需要非常高的试剂浓度（通常约为0.1M）以促进快速固相反应，而酶促合成通常使用0.001至0.01M范围内的单体浓度。因此，仅从单体成本的角度来看，两种方法的试剂成本相差不多几个数量级。酶促合成仍处于早期发展阶段，预计随着规模的扩大，将有更多机会降低合成成本。

【NO.8】总结与展望

酶促寡核苷酸合成起源于20世纪中叶，直到最近才成为人们关注的焦点。这种兴趣的重新抬头可归因于化学合成方法的持续挑战、对高质量寡核苷酸的日益增长的需求以及社会对环境可持续性的日益关注。利用蛋白质工程、有机合成、固相合成和测序技术的进步，酶促寡核苷酸合成在过去十年中取得了长足的进步。许多公司如雨后春笋般涌现，将这项技术商业化。他们提供合成长DNA序列的服务，并正在开发桌面DNA打印机。专门从事RNA合成的公司专注于用于治疗和诊断应用的修饰寡核苷酸。预计这些初创公司的资金和开发计划将加速酶促寡核苷酸合成技术的发展。尽管如此，该领域仍处于研发阶段，尚未完全成熟。

目前，寡核苷酸的酶促从头合成面临几个障碍。合成过程的效率和准确性是主要关注点。虽然化学合成通常达到大约99.5%至99.7%的逐步效率，但酶合成必须超过此效率并接近近乎完美的水平才能提供优势。尽管温和的反应条件可以防止碱基损伤，但缺失、插入和替换等错误仍然存在，这些错误可能由酶介导的合成过程中的各种元素触发。除了综合质量之外，还需要解决与可扩展性和吞吐量相关的问题。满足这些要求需要优化的酶生产、细致的过程控制和自动化。此外，降低生产成本对于确保酶合成能够与传统化学方法竞争至关重要。

尽管存在这些挑战，但从头酶合成已经显示出显著的优势。它的环保特性和生成更长、高度复杂序列的能力尤其值得注意。随着人工智能辅助酶设计和高通量寡核苷酸分析方法等不断的进步，这些瓶颈正在被克服。未来，酶促合成有望彻底改变寡核苷酸生产，为传统方法提供可持续且高效的替代方案。

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