酸茶属于发酵茶，是我国云南少数民族的传统茶叶制品，其汤色金黄通透，带有独特的酸香。它是以大叶种茶树的茶叶为原料，经杀青、揉捻、厌氧发酵（埋入地下或陶罐密封）、干燥等工艺制成，整个过程主要通过厌氧发酵中微生物的代谢作用赋予茶叶独特的酸味和香气。
目前的酸茶生产多采用传统的自然发酵工艺，易导致酸茶发酵污染、风味品质不稳定等问题。人工接种发酵是解决这类问题的有效手段之一，有利于实现酸茶的工业化生产并保证其风味品质。在酸茶的厌氧发酵过程中，优势菌群是以乳酸菌为主的细菌和酵母菌。本课题组在前期研究中从泡菜和红茶菌中筛选到产酸能力强且耐受茶多酚和单宁的两株菌，经鉴定并命名为肠膜明串珠菌C2（
Leuconostoc mesenteroidesC2）和二孢接合酵母菌H3（
Zygosaccharomyces bisporusH3）。
中国海洋大学食品科学与工程学院的李琴芳、徐莹*、汪东风等重本研究以来自云南绿春的茶叶为原料，在发酵初期加入
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3进行恒温厌氧发酵，利用电子鼻、电子舌、气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术从香气和滋味方面探究人工接种菌株对酸茶风味的影响，同时进行感官评价，通过多变量统计分析，阐释接种发酵和自然发酵的酸茶的差异性风味组分，旨在为酸茶的工业化生产提供新思路、新方向。
1
理化成分分析
如表3所示，JY和ZY组酸茶的水浸出物、游离氨基酸和可溶性蛋白含量无显著差异。茶叶中含有的可溶性蛋白对茶汤有一定的稳定作用，对茶汤滋味有影响。然而，JY和ZY组酸茶可溶性糖、黄酮类化合物、茶多酚、茶氨酸、没食子酸、咖啡碱和总酸含量存在显著差异。JY组酸茶的黄酮类化合物（1.81%）、茶氨酸（0.62%）质量分数显著高于ZY组。茶氨酸是茶叶中特有的非蛋白类氨基酸，不仅能够与丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和甘氨酸等其他氨基酸协同增强茶汤鲜味，还可以减弱咖啡碱和茶多酚引起的苦涩味，而且具有多种生理功效。但JY组酸茶的茶多酚（25.37%）和没食子酸（0.76%）质量分数显著低于ZY组，而且ZY组的酸度更高。茶多酚在缺氧的酸性条件下更稳定，这可能是
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3的存在阻碍了茶多酚和没食子酸的转化；还可能是由于耐单宁的乳酸菌和酵母菌能分泌单宁酶降解茶多酚，且厌氧发酵中
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3可能使没食子酸合成途径受阻。马玉青等研究发现德昂酸茶的茶多酚相对含量能达到24.66%，与本研究结果相似。此外，JY组的咖啡碱质量分数（3.59%）显著低于ZY组（3.91%），这或许是接种菌株在发酵过程中降解了咖啡因。
整体来看，JY与ZY组酸茶差异显著，这种差异主要是接种微生物带来的，说明接种干扰了发酵过程微生物群落结构。发酵过程中的物质转化涉及到很多因素，如发酵温度、发酵时间和发酵微生物等。发酵后的干燥、研磨等操作也会影响实验结果。然而，本研究主要分析接种对风味的影响，微生物的作用及其他影响因素还有待进一步研究。
2
电子鼻分析
PCA是一种无监督分析方法，可以初步了解各组样本之间的总体差异和组内样本之间的变异度大小。PC1和PC2的方差贡献率分别是60.9%和21.1%（图1a），两组样本分布在不同象限，区分明显，且各组基本聚为一处，说明两组酸茶的香气存在差异。图1b中JY组酸茶W2S（对醇类化合物敏感）和W2W（对芳香成分和有机硫化物敏感）的响应值高于ZY组，W1W（对无机硫化物敏感）和W5S（对氨氧化合物敏感）的响应值显著低于ZY组，说明
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3对酸茶呈香成分中的醇类化合物、有机和无机硫化物、氨氧化合物的产生有影响。He Zhen等研究发现
L. mesenteroides与几种醇类挥发性化合物之间存在显著的正相关，如1-己醇、顺-庚-4-烯醇、1-辛醇、芳樟醇、苯乙醇、3-苯丙醇。Li Meilun等研究发现Z. bisporus与大多数挥发性风味化合物呈显著正相关，主要包括酯类（如水杨酸甲酯和亚油酸乙酯）、醇类（如苯乙醇、芳樟醇和-松油醇）、酚类（如4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚）和酮类（如-大马士酮）。含氮和含硫化合物主要包括底物中的蛋白质和氨基酸，它们在发酵过程中通过微生物代谢转化为衍生物，如氨、吡嗪、吡咯、噻唑、三甲胺和胺类化合物，可能是由于
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3直接或间接地影响了酸茶发酵过程中蛋白质和氨基酸的转化。
JY组醇类和芳香成分比ZY组的响应突出，但是无机硫化物和氨氧化合物响应弱，可能是JY组pH值适合酵母菌生长繁殖，产醇类多，醇与酸相互反应产生酯类香气物质。而其他挥发性风味化合物的传感器响应值无明显区别。
3
GC-IMS分析
3.1 挥发性风味化合物的比较分析
在JY和ZY组酸茶样本中均检测出64 种挥发性风味化合物（图2），具体成分见表4。鉴定出的挥发性风味化合物包括单体（M）和二聚体（D），可分为醇类21 种、醛类13 种、酸类1 种、酯类8 种、酮类12 种、脂环烃类2 种、烷烃类1 种、呋喃类2 种、吡嗪类1 种、其他类3 种。由图2可知，两组酸茶中醇类均检测出芳樟醇，呈现出花香，且其相对含量显著高于其他醇类，与Zheng Yaru等研究结果一致，是组成酸茶香气的主要化合物。在厌氧发酵过程中，茶叶暴露于高湿度和微生物的环境中，可引起香气前体的复杂变化，这些变化往往会导致芳樟醇及其氧化物等含量的升高。此外，相比ZY组酸茶，JY组中醇类1-丙醇、2-甲基丙醇和3-甲基-1-丁醇的相对含量较高，呈现出果香；醛类2-甲基-(
Z)-2-丁烯醛和2-甲基丙醛的相对含量较高，呈现出可可香和果香。醛类化合物的形成可能与不饱和脂肪酸的氧化降解和氨基酸的Strecker降解有关。此外，微生物转氨酶可以将游离氨基酸转化为-酮酸，在发酵过程中被各种脱羧酶进一步降解为相应的醛类；酸类中3-甲基丁酸是茶叶中的重要香气成分，表现为果香和坚果香；JY组中酮类3-羟基-2-丁酮和3-辛酮的相对含量较高于ZY组。酮类化合物主要是由氨基酸发生美拉德反应和热改性以及游离脂肪酸氧化后生成的；JY组中酯类丁酸乙酯和丁酸甲酯的相对含量比ZY组高。酯类化合物多为短链脂肪酸，短链脂肪酸酯是一类低分子质量的化学物质，主要由醇与短链脂肪酸发生酯化反应生成。在发酵食品中，这些酯类物质主要由微生物中羧酸酯水解酶超家族（EC 3.1.1.-）的酶合成，从而形成独特的风味，影响感官品质和风味特征；呋喃类化合物主要来源于糖和氨基酸之间通过美拉德反应生成的中间体或最终产品，主要具有果香和烟熏香气。如JY组酸茶中2-正戊基呋喃和2-乙基呋喃的相对含量高于ZY组。
以上结果表明，JY和ZY组酸茶的挥发性风味化合物种类丰富，且两组酸茶的风味化合物的相对含量存在显著差异。JY比ZY组酸茶的醇类、醛类和呋喃类化合物的相对含量较高，可能是
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3 参与了重要的氨基酸降解和脂肪酸代谢过程，从而提高了酸茶的香气丰富度，即人工接种发酵酸茶的风味更好。
3.2 差异挥发性风味化合物分析
根据有监督的OPLS-DA，样本全部处于95%置信区间，说明该模型的预测能力较好。JY和ZY组酸茶样本分布在置信区间的右侧和左侧，区分效果明显（图3a），与电子鼻分析结果相印证，表明两组样本挥发性风味化合物差异显著。
根据变量投影重要性（VIP）＞1且
P＜0.05，筛选到17 种差异性风味化合物，结果如图3c所示。在JY组酸茶中3-甲基-1-丁醇（D）、2-甲基丙醇（M/D）、三环烯、1-戊醇（D）、1-丙醇（M）、2-甲基-(
Z)-2-丁烯醛、2-正戊基呋喃、2-乙基呋喃共9 种差异性风味化合物相对含量明显高于ZY组，呈现出的果香、酒香和木香突出；2-戊酮、(
E)-2-己烯醛（M）、3-戊醇（M）、庚醛（M/D）、6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛（M）相对含量明显低于ZY组，进一步说明两组酸茶在香气组成上差异显著，不同风味化合物含量呈现的香气强弱不同。
以上结果表明，
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3的添加增加了大多数醇类、醛类和呋喃类化合物的相对含量。在酸茶发酵过程中
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3极大可能参与了重要的氨基酸降解和脂肪酸代谢过程，产生各种醇类、醛类、酸类、酯类和含硫化合物，形成不同风味特征 。
4
电子舌分析
如图4所示，两组酸茶在鲜味、后涩味和后苦味方面无明显差别。但JY组酸茶鲜味丰富性、苦味响应值略高于ZY组，涩味和酸味响应值低于ZY组。这可能因为ZY组酸茶的茶多酚、没食子酸以及总酸含量高，而茶多酚主要提供茶汤涩味；没食子酸具有酸味，浓度高时会产生苦涩味，这就使得ZY组的涩味和酸味强。由此说明
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3对酸茶的滋味构成有一定的影响，可能是在发酵过程中氨基酸、糖、茶多酚、有机酸等物质发生了转化和形成。这些多酚类、生物碱类、氨基酸类、碳水化合物类和有机酸类等化学物质提供或贡献了苦、涩、鲜、甜的茶汤滋味。整体而言，JY组酸茶的滋味优于ZY组。
5
LC-MS/MS分析
5.1 PCA
使用无监督的PCA进行初步分析。由图5可知，PC1和PC2的方差贡献率分别是29.54%和14.66%，两组样本明显各自聚集，得到有效区分，说明组间成分存在显著差异，数据值得进一步分析。
5.2 PLS-DA
进一步使用有监督的PLS-DA。由图6可知，PC1方差贡献率为29.48%，PC2方差贡献率为12.81%，＝0.92，时表明模型稳定可靠。两组样本全部处于95%置信区间内，且区分效果明显，表明两组酸茶样品代谢物成分差异非常显著，可以进行差异代谢物分析。模型预测指数R2＞Q2且Q2回归线与Y轴截距小于0，表明模型未“过拟合”，更加说明该评估模型有效。
5.3 差异代谢物分析
基于PLS-DA结果，根据VIP＞1、差异倍数（FC）≥2或FC≤0.5、
P＜0.05得到差异代谢物的火山图。如图7、8所示，共鉴定出164 种差异代谢物，其中72 个代谢物上调，92 个代谢物下调。聚类热图中颜色越接近蓝色，相对含量越低，即负表达；越接近红色，相对含量越高，即正表达。JY组酸茶有72 种代谢物相对含量显著高于ZY组，92 种代谢物相对含量显著低于ZY组。两组酸茶在代谢物种类和相对含量上的差异，形成了各不相同的滋味特征，说明
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3对酸茶发酵过程中代谢物的转化生成有一定的影响，如氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸代谢等，都可能对酸茶的滋味产生有利或不利的作用。
选择VIP值前10的差异性代谢物，如表5所示。其中6-甲基喹啉、次黄嘌呤、香紫苏内酯在JY组酸茶的相对含量高于ZY组。6-甲基喹啉是所有代谢物中FC最高的物质，高达48.29。其在JY组的相对定量均值为4.93×107，在ZY组中相对定量均值为1.02×106。6-甲基喹啉是一种中度活性乏氧选择性细胞毒剂，具有一定的放射增敏作用，可用于合成细胞间质上皮转换因子抑制剂，在抗肿瘤方面表现出一定的药理活性。关于6-甲基喹啉在茶叶中的研究鲜见报道，本研究结果显示6-甲基喹啉在JY组酸茶贡献较大，这可能与添加的菌株参与发酵过程有关，但形成机制尚不清楚，仍需进一步研究探讨；次黄嘌呤是茶树重要代谢物之一，与茶的鲜味和苦味有关。研究发现不同微生物对茶叶中嘌呤生物碱含量和种类有不同的影响，次黄嘌呤作为嘌呤生物碱的代谢产物之一，其含量的变化对茶叶的风味有重要的影响。其在JY组的相对定量均值为1.42×108，在ZY组的相对定量均值为5.08×106；香紫苏内酯天然存在于植物中，不仅具有良好的抗菌活性和细胞毒性作用，而且具有柏木香、烟草香以及蘑菇香。香紫苏内酯能够提高食品的感官效果，增加食品的嗅觉效果。其在JY组的相对定量均值为1.80×107，在ZY组的相对定量均值为6.62×106。此外，JY组酸茶腺苷、N4-(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)吗啉-4-羧酰胺、醌类化合物、没食子酸甲酯、5-(羟甲基)-4-甲氧基-2,5-二氢呋喃-2-酮、苯哒嗪钾、槲皮素含量则低于ZY组。在这些代谢物中腺苷是一种嘌呤核苷，是5’-一磷酸腺苷、5’-二磷酸腺苷、5’-三磷酸腺苷和环状腺苷单磷酸的前体，主要贡献茶叶的鲜味，对茶叶滋味有一定的影响；醌类化合物在茶中形成主要是由于多酚类物质在湿热作用下发生非酶性氧化和异构化作用，这些物质会导致茶汤变褐，并且可能会与氨基酸进一步反应，使茶汤滋味变劣；没食子酸甲酯是一种天然存在的多酚类化合物，广泛存在于植物中，主要是由没食子酸转化而成，对茶叶的滋味有显著影响；槲皮素是一种黄酮类化合物，具有强效的抗氧化作用。Zhu Wan等研究发现槲皮素苷是区分‘白叶1号’与其他茶品种的特征化合物，这种类黄酮苷是‘白叶1号’潜在的关键苦涩味成分。槲皮素贡献茶汤涩味，在JY组的相对定量均值为2.02×109，在ZY组的相对定量均值为6.25×109，涩味过重对茶汤滋味的协调是不利的。
JY与ZY两组酸茶在代谢物上存在显著差异，并且这些差异代谢物影响酸茶的滋味，有些含量过多会给酸茶带来不好的滋味呈现，有些则会协调酸茶的苦味和涩味，使其滋味更加醇厚柔和。整体而言，这些差异代谢产物对于接种发酵和自然发酵酸茶的不同滋味形成有重要贡献。
6
感官评价分析
对干燥后的JY和ZY组酸茶进行感官评价，结果如表6所示。整体上JY组酸茶的感官总分高于ZY组，但两者之间未达到显著差异。从感官评分数据来看，JY组酸茶在香气和滋味方面的得分均优于ZY组，说明JY组酸茶的风味更为突出，
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3的混合接种发酵在一定程度上提升了酸茶的风味。
结 语
本研究将
L. mesenteroidesC2和
Z. bisporusH3混合接种发酵酸茶，以自然发酵组为对照，通过电子鼻、电子舌、GC-IMS、LC-MS/MS和感官评价等方法进行分析。结果表明，JY组的黄酮类化合物和茶氨酸含量显著高于ZY组，但咖啡碱含量显著低于ZY组。电子鼻和GC-IMS分析显示，JY组酸茶的醇类、芳香成分和有机硫化物的相对含量较高，筛选出17 种特征性风味化合物，其中9 种（如2-甲基丙醇、1-戊醇和2-甲基-(Z)-2-丁烯醛等）在JY组中相对含量更高，呈现出果香、酒香和木香。电子舌结果表明，JY组在鲜味丰富性上优于ZY组，涩味和酸味比ZY组弱。LC-MS/MS检测到164 个差异代谢物，其中JY组中有72 个代谢物上调，关键差异代谢物（如6-甲基喹啉、次黄嘌呤和香紫苏内酯）在JY组中的相对含量显著高于ZY组。感官评分说明，JY组酸茶的香气和滋味呈现更优，接受度更高。因此，人工接种发酵有利于提升酸茶的风味，改善酸茶的品质，本研究可为酸茶的工业化生产提供理论支持。
本文《人工接种发酵和自然发酵酸茶的风味差异分析》来源于《食品科学》2025年46卷第16期222-231页，作者：李琴芳，徐莹*，汪东风，汪明明，白秀芳，李戈，李聪元。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250201-001。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：闫凯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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