HEK293报告基因法在贝伐珠单抗生物学活性检测中的应用|单抗|基因法|抗体|效价|活性检测|生物学|细胞|贝伐珠

中文摘要

目的探索HEK293报告基因法（reporter gene assay，RGA）检测3个厂家贝伐珠单克隆抗体（单抗）产品的可行性。

方法采用RGA分别检测3个厂家贝伐珠单抗产品的生物学活性，并对该方法的线性、准确度、精密度进行验证，探索胎牛血清浓度、细胞铺板密度、细胞培养代次对RGA检测结果的影响。

结果RGA检测3个厂家贝伐珠单抗产品绘制的四参数曲线显示，厂家-2信噪比高，厂家-2和厂家-3拟合度好；理论相对效价为50%~150%时，相对效价的理论对数值与其效价测定值呈现良好的线性关系；3个厂家产品的回收率均在70%~130%之间，相对标准偏差均＜20%；胎牛血清浓度为5%和10%，细胞铺板密度在0.6×105、0.9×105和1.2×105个/孔，细胞代次8、16、23代时，活性测定拟合曲线较好。

结论RGA能实现对3个厂家贝伐珠单抗产品的生物活性检测，虽然方法的线性、准确度、精密度良好，但胎牛血清浓度、细胞铺板密度及细胞代次对RGA检测结果有一定影响。

正文

肿瘤的生长、维持与转移都离不开血管生成，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为高度特异性的促血管生成因子，可与VEGF受体结合，刺激内皮细胞的增殖、迁移和新生血管的形成，从而促进肿瘤的生长和转移。贝伐珠单克隆抗体（单抗）为抗肿瘤药物，其作用机制是通过与VEGF特异性结合，阻断VEGF信号传导，抑制肿瘤新生血管的形成。

报告基因法（reporter gene assay，RGA）可用于检测贝伐珠单抗生物学活性，具有较高的灵敏度和特异性。其基本原理为贝伐珠单抗与HEK293细胞上表达的VEGF受体2竞争性结合VEGF，导致VEGF诱导的报告基因检测系统中的萤光素酶表达水平降低，后通过加入萤光素酶作用底物产生的荧光信号来判断其生物学活性。本研究采用3家公司贝伐珠单抗产品作为供试品，分别对RGA进行验证，因细胞密度、血清浓度等参数对检测方法可能有影响，本研究设定不同参数进行实验，以期找到最优参数，为RGA在抗体药物检测中的应用奠定基础。

材料与方法

1.1

贝伐珠单抗

选择3个厂家（厂家-1、厂家-2、厂家-3）的3批贝伐珠单抗产品作为供试品，对应参比品由同厂家提供。

1.2

主要试剂与仪器

NFAT-RE-Luc2P/KDR HEK293转染细胞株（批号：0000385065）和Bio-GloTM Luciferase Assay System萤光素酶显色液（批号：0000495016）均购自美国Promega公司；重组人 VEGF165（批号：II6521081）购自美国R&D Systems公司；DMEM高糖培养基和PBS（pH7.4）均购自美国Hyclone公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、遗传霉素和潮霉素B均购自美国Gibco公司。

Thermo 3111二氧化碳培养箱和Thermo Sorvall离心机均购自美国Thermo公司；OLYMPUS CKX53显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；ESCO AC2-6S8-CN生物安全柜购自新加坡Esco公司；Countstar IC100细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司；Spectra Max iD5 酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.3

细胞的复苏、传代与冻存

将冻存管中NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞悬液收集至离心管中，加入9 mL 含体积分数10% FBS的DMEM高糖培养基，100×g离心5 min，弃去上清液，剩余物用上述培养基液重悬，接种至培养瓶，在37 ℃、5%CO2条件下复苏培养。待细胞长满后，用胰蛋白酶消化，细胞悬液收集至离心管中，100×g离心5 min，弃去上清液，部分剩余物用DMEM高糖培养基（含10% FBS、100 μg/mL潮霉素B、250 μg/mL遗传霉素）重悬，接种至培养瓶，在37 ℃、5%CO2条件下进行细胞传代培养；部分剩余物采用含10% DMSO及10% FBS 的DMEM高糖培养基重悬，分装至冻存管，放入程序降温盒中，置于-80 ℃冰箱冻存。

1.4

贝伐珠单抗的生物学活性检测

采用RGA检测3个厂家的3批贝伐珠单抗的生物学活性。取1.3中处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，细胞悬液收集至离心管中，100×g离心5 min，弃去上清液，剩余物用不同浓度稀释液（含10% FBS的DMEM高糖培养基）重悬，调整细胞密度至相应浓度（表1），并接种于96孔培养板中，设置3复孔。用不同浓度稀释液（含FBS和VEGF165的DMEM培养基）将贝伐珠单抗参比品和供试品稀释至3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.88、23.44、11.72、5.86 ng/mL，并添加至上述96孔培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养5～7 h。3个厂家产品的细胞接种密度及稀释液中的VEGF165浓度、FBS浓度详情见表1。

取出细胞培养板放至室温，加入萤光素酶底物溶液，室温避光孵育5～10 min后，使用多功能酶标仪读取相对荧光单位（relative light unit，RLU）值。使用Softmax Pro 7.0软件，以参比品和供试品溶液浓度对数为横坐标、各浓度对应的RLU对数为纵坐标，绘制四参数曲线，四参数曲线方程中的A值为拟合曲线上限值，B值为曲线的斜率，C值为有效中浓度（median effective concentration，EC50），D值为拟合曲线下限值。计算信噪比（A/D），并根据以下公式计算供试品的相对效价。

相对效价=参比品EC50/样品EC50×100%

1.5

方法验证

1.5.1　线性与范围使用稀释液分别将3个厂家的3批供试品稀释成相对效价为50%（1 500 ng/mL）、75%（2 250 ng/mL）、100%（3 000 ng/mL）、125%（3 750 ng/mL）及150%（4 500 ng/mL）的溶液，每个供试品设置3复孔，按照1.4的方法检测供试品的实际相对效价，独立测定3次。以效价理论值的对数为横坐标、相应的效价测定值的对数为纵坐标进行线性回归，计算回归曲线的决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.90。

1.5.2　准确度按1.5.1描述稀释并检测供试品的实际相对效价，各浓度均检测3次，计算回收率。可接受标准：回收率在70%~130%之间。

1.5.3　精密度按1.5.1描述稀释并检测供试品，各浓度重复检测3次，计算每个浓度检测结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），可接受标准：RSD＜20%。

1.6

RGA检测方法的影响因素

考察FBS浓度、细胞铺板密度、细胞代次对贝伐珠单抗生物学活性检测的影响，拟合曲线上下平台的差值较大者更优。

1.6.1　FBS浓度将1.3中DMEM培养基的FBS浓度设定为1%、5%和10%，其他条件不变，检测厂家-3贝伐珠单抗的生物学活性。

1.6.2　细胞铺板密度以厂家-3贝伐珠单抗为研究对象，将1.4中96孔接种板分别设为0.3×105、0.6×105、0.9×105和1.2×105个/孔，其他条件不变，检测厂家-3贝伐珠单抗的生物学活性。

1.6.3　细胞代次将1.3中传代培养至第6代（P6）、P14、P21、P32 的NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞用含10% DMSO及10% FBS的DMEM高糖培养基冻存，冻存完成后取出并分别将细胞复苏至P8、P16、P23、P34，细胞活率恢复至90%以上，检测厂家-3贝伐珠单抗的生物学活性。

结果

2.1

贝伐珠单抗的生物学活性检测相关数据统计结果

3个厂家产品的信噪比计算结果见图1，厂家-1和厂家-3数据分布较为集中，厂家-1信噪比的整体数值较高，厂家-3信噪比的整体数值较低，厂家-2在培养前期信噪比较低，后期信噪比较高，可能受细胞状态影响，细胞复苏后信噪比升高。

3个厂家的四参数曲线斜率结果见图2，3个厂家产品引发的响应值变化的陡峭幅度基本相同，厂家-2产品数据分布较为分散，说明产品检测时稳定性较差。四参数曲线的决定系数检测结果见图3，3个厂家的R2整体相似，厂家-2和厂家-3数据更为集中，拟合度更好。

2.2

线性与范围

如图4所示，3个厂家3批产品的相对效价理论值为50%、75%、100%、125%、150%时，回归曲线R2分别为0.933 7、0.952 0和0.935 6，均大于0.90，表明该方法在理论相对效价为50%~150%时，相对效价的理论对数值与其效价测定值呈现良好的线性关系。

2.3

准确度

由表2可知，3个厂家供试品相对效价理论值为50%、75%、100%、125%、150%时回收率均在70%~130%之间，符合规定，表明该方法的准确度良好。

2.4

精密度

3个厂家3批产品重复3次检测结果见表3，RSD均小于20%，表明该方法具有良好的精密度。

2.5

RGA检测方法的影响因素

虽然RGA均能检测3个厂家的贝伐珠单抗的生物学活性，但FBS浓度、细胞铺板密度及细胞代次对检测结果有一定影响。根据“S”型曲线的上下平台的差值来评价整体拟合情况，由图5可知，FBS浓度为5%和10%时，活性测定拟合曲线较优；由图6可知，细胞铺板密度在0.6×105、0.9×105和1.2×105个/孔时，活性测定拟合曲线均表现较优；由图7可知，在细胞代次P8、P16、P23代活性测定拟合曲线均表现较优。

生物学活性是贝伐珠单抗药物的关键质量属性之一，其检测方法主要有细胞增殖抑制法和RGA。RGA较传统细胞增殖抑制法具有操作简便、周期短、变异度小、高效、特异性高等优点，目前应用较多。可靠稳定的检测生物活性的RGA除了细胞系和细胞通路的选择，通常还需注意优化方法参数，如细胞密度、孵育时间等。目前文献报道和不同厂家使用的RGA，虽然都实现了贝伐珠单抗的检测，但方法的参数仍存在差异，导致方法验证数据的差异。本研究结合文献报道和不同厂家使用的RGA，用3家公司的贝伐珠单抗对RGA进行验证，深入比较方法验证结果和拟合曲线数据参数，筛选影响实验表现的关键参数，对其进行研究，为后续报告基因法的开发提供参考。

方法验证结果中，RGA可实现对3个厂家的贝伐珠单抗的检测。精密度测定中，相对效价50%、75%、100%、125%及150%的样品RSD均小于20%，方法精密度良好；准确度测定中，相对效价50%、75%、100%、125%及150%的样品回收率均在70%~130%范围，方法准确度良好。以5组不同浓度样品相对效价的理论值对数值与其效价测定值对数值拟合回归直线，R2均大于0.90，方法线性拟合较好，测定范围为50%~150%。考虑到3个厂家贝伐珠单抗在实验操作中细胞接种密度、稀释液中的VEGF165浓度、FBS浓度不同，深入分析验证数据和拟合曲线数据发现，在不同稀释组测得相对效价的RSD、相对效价的理论值与其效价测定值拟合回归直线的R2方面，厂家2产品表现略优，而最大的不同为细胞接种密度，其影响也反映在信噪比表现方面，厂家2受细胞培养影响较大。在相同细胞密度下，厂家1信噪比表现较厂家3更优，说明信噪比还受稀释液血清浓度等其他参数影响，由于稀释液中的血清浓度影响细胞生长速度，因此推测主要是稀释液的血清浓度引起细胞最终密度的不同。因细胞密度、血清浓度、细胞代次等参数对检测方法均有一定影响，故设定不同参数进行实验。实验结果显示，血清浓度为5%和10%时，活性测定拟合曲线较优；细胞铺板密度在0.6×105、0.9×105和1.2×105个/孔时，活性测定拟合曲线均表现较优；细胞代次方面，P8、P16、P23代活性测定拟合曲线均表现较优。

综上所述，RGA可实现对3个厂家贝伐珠单抗的生物活性检测，且细胞密度及相关参数（稀释液血清浓度等）对检测方法的表现有一定影响，在开发与优化RGA时需对其重点关注。本研究通过设定不同参数进行试验，探索RGA的血清浓度（5%和10%）、细胞铺板浓度（0.6×105、0.9×105和1.2×105个/孔）及细胞代次（P8~P23）最优参数，为RGA在抗体药物检测中的应用奠定基础。

作者

凌莉戴国英张国林

苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215000

通信作者：张国林，

Email：zhangguolin2006@163.com

引用本文：凌莉, 戴国英, 张国林. HEK293报告基因法在贝伐珠单抗生物学活性检测中的应用[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(6): 387-392.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250109-00002

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