Cell | CRISPR筛选揭示tau蛋白稳态的调控原则|复合物|磷酸化|线粒体|细胞|蛋白酶

撰文|一只鱼

Tau蛋白病是一类神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD），其特征为tau蛋白聚集，且目前缺乏有效疗法。Tau蛋白本质上是一种无序蛋白，其经典功能是调节微管的稳定性与动态。编码tau蛋白的基因MAPT发生突变会导致家族性额颞叶痴呆（FTD）。然而包括AD在内的大多数tau蛋白病病例是散发性的，这表明细胞环境中的某些因素控制着缺乏疾病突变的病理性tau蛋白的累积。此外，大脑的特定区域及其内的特定神经元亚型对不同的tau蛋白病具有易感性。但目前仍不清楚是哪些细胞因素控制tau蛋白聚集。

近日，来自美国加州大学旧金山分校的Martin Kampmann研究团队在Cell上发表题为CRISPR screens in iPSC-derived neurons reveal principles of tau proteostasis 的文章，在诱导多能干细胞（iPSC）分化的人神经元中进行了全基因组CRISPRi筛选，发现了已知及意料之外的调控tau寡聚体水平的通路，包括UFM化和GPI锚定生物合成途径。筛选发现E3泛素连接酶CUL5 SOCS4复合物控制人神经元中的tau蛋白水平，能泛素化tau蛋白，并且其表达与人类疾病中对tau蛋白病的耐受性相关。线粒体功能破坏会促进tau蛋白的蛋白酶体异常加工，从而产生与疾病相关的tau蛋白水解片段，并在体外改变tau蛋白的聚集特性。

研究人员首先在携带FTD致病突变MAPT V337M的iPSC来源神经元中，利用抗tau寡聚体抗体T22进行全基因组CRISPRi筛选。初筛鉴定出1143个能显著调节tau寡聚体水平的基因。通路富集分析显示，氧化磷酸化、自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS）是调控tau寡聚体的核心通路。其中，敲低氧化磷酸化相关基因会显著提升tau寡聚体水平，揭示了线粒体功能与tau病理之间的紧密联系。为增加结果的可靠性，他们进行了多项二次筛选，使用了不同的tau寡聚体抗体（TOC1、M204）并对比了总tau水平的变化。结果证实，氧化磷酸化、自噬和UPS通路在多种检测条件下均显著富集。

在所有的筛选中，他们都鉴定到了编码E3泛素连接酶支架蛋白的CUL5基因。CUL5与其衔接蛋白SOCS4、调节蛋白RNF7、ARIH2等共同构成CRL5 SOCS4复合物，该复合物能直接与tau蛋白相互作用，并介导其泛素化，尤其是对tau蛋白第80-130位氨基酸区域的赖氨酸（如K83, K85）进行多聚泛素化修饰，从而靶向tau并通过蛋白酶体途径降解。在神经元中敲低CUL5或RNF7会导致tau蛋白和tau寡聚体水平升高；而过表达SOCS4则能降低tau水平。体外重组实验进一步验证了CRL5 SOCS4复合物对tau的直接泛素化活性，且该过程依赖于NEDD化修饰和ARIH2的参与。对AD患者脑组织单细胞转录组数据的分析发现，在AD中存活的耐受性神经元内，CUL5、SOCS4和ARIH2的表达水平显著高于易受损神经元。这种表达差异在兴奋性神经元和生长抑素（Sst）抑制性神经元中尤为明显，并且也存在于其他tau蛋白病（如进行性核上性麻痹PSP）的耐受性神经元中。这表明CRL5 SOCS4介导的tau蛋白降解通路可能是神经元在tau病理压力下存活的重要内在保护机制。

针对另一个筛选发现的通路，线粒体电子传递链（ETC），研究人员使用鱼藤酮（复合物I抑制剂）进行验证。他们发现，ETC抑制不仅增加总tau和寡聚体水平，更诱导产生一个约25-kDa的N端tau片段。该片段由蛋白酶体切割产生，其生成依赖于活性氧（ROS）的积累，并可被抗氧化剂部分抑制。重要的是，该片段能被分泌到细胞外培养基中，并且其释放水平与用于AD诊断的脑脊液生物标志物NTA（N端tau）高度相关。研究人员进一步探究了这一病理性片段的功能后果。体外实验表明，纯化的tau 1-172片段（模拟25-kDa片段）能够延长tau纤维形成的延滞期，并改变最终纤维的四级结构，使其更加刚直。这说明，在疾病早期由氧化应激和蛋白酶体功能改变产生的tau片段，可能作为“种子”或调节剂，改变全长tau的聚集路径和最终纤维形态，从而加剧病理。