胰腺消化稳态的维持依赖于胰蛋白酶原的正确激活，这一过程由十二指肠刷状缘丝氨酸蛋白酶——肠肽酶（Enteropeptidase, EP）特异性催化。肠肽酶通过识别胰蛋白酶原N端的DDDDK序列，精准切割激活肽，启动消化酶级联反应。肠肽酶功能缺陷可导致严重消化不良，而其异常 reflux 则与急性胰腺炎等病理状态密切相关。尽管肠肽酶的生物学重要性明确，但其如何通过重链中的非催化结构域（如CUB2）实现大分子底物的高效识别与切割，分子机制长期不明。
2026年3月16日，《美国国家科学院院刊》（PNAS）在线发表了海军军医大学李兆申、黄浩杰、Ding Zhanyu团队题为《Structural insight into the CUB2 domain's role in enteropeptidase-mediated trypsinogen activation》的研究论文。该研究通过冷冻电镜技术结合功能分析，首次高分辨率揭示了肠肽酶-胰蛋白酶原复合物的三维结构，阐明了CUB2结构域通过表面电荷与环区动态调控底物切割效率的分子基础。
研究团队首先通过构建N端截短体（EP504-1019），发现去除CUB2上游结构域后，肠肽酶对胰蛋白酶原的切割效率显著降低，证实CUB2、LDLR2及SRCR构成的大分子底物切割核心单元中，CUB2直接介导底物识别。随后对CUB2结构域18个残基进行丙氨酸扫描，发现E574A突变体切割活性增强，而N619A、D578A等突变体效率显著下降，提示表面带电残基对活性调控至关重要。
为解析其分子机制，研究团队解析了肠肽酶-胰蛋白酶原复合物2.95 Å的高分辨率结构。结构显示，肠肽酶重链形成拱形结构包裹催化轻链与底物，胰蛋白酶原尾部呈现两种构象：State-1中尾部悬于CUB2-MAM连接区，State-2中则深入催化中心。CUB2通过L573-D578与N619-R624两个环区与底物相互作用，E574与D578形成局部负电区域，与底物负电表面产生静电博弈，N619则邻近DDDDK序列引导其进入活性位点。
进一步解析E574A与N619A突变体的单独及底物结合结构发现，E574A消除了局部负电，增强底物亲和；N619A则因表面负电增强产生静电排斥，导致结合颗粒比例降低。表面等离子体共振实验显示各变体结合亲和力相当，表明CUB2主要调控切割速率而非初始结合。底物结合后，突变体间电荷差异消失，提示交联剂可能掩盖动态静电效应。
基于构象差异，研究提出肠肽酶蛋白水解循环模型：CUB2-MAM连接区通过T515与P517识别DDDDK序列，启动底物招募；MAM与CUB结构域引导底物向核心区迁移；CUB2表面电荷（E574、N619）调控尾部进入催化中心的效率；最终催化口袋完成切割，释放活性胰蛋白酶，肠肽酶恢复动态构象进入下一循环。该模型揭示了非催化结构域通过动态静电匹配精准调控丝氨酸蛋白酶活性的普遍机制。
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