仿生水凝胶微柱阵列：构建生理相关微环境，革新中枢神经系统髓鞘化研究
中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病，如多发性硬化症，以少突胶质细胞形成的髓鞘受损或丢失为特征，导致神经信号传导中断及感觉、运动、认知功能障碍。尽管少突胶质细胞及其前体细胞在成人大脑中仍保留髓鞘再生能力，但调控中枢神经系统髓鞘化的分子与物理因素仍未被完全阐明。神经元和细胞外基质的机械生物学信号是髓鞘化的关键调控因子，因为少突胶质细胞对基底硬度的机械敏感性会影响其突起的延伸与包裹行为。传统的体外模型，如电纺纳米纤维，虽能精确控制几何参数，但其材料硬度通常高达1 GPa以上，远高于原生轴突约5 kPa的弹性模量，这种机械不匹配可能导致非生理性的少突胶质细胞反应。尽管近期出现了一些改进的人工轴突平台，但它们往往无法在生理相关范围内同时调控几何参数与硬度，且多数未能展示致密的多层髓鞘或支持人源少突胶质细胞培养，限制了其生理相关性和转化应用价值。
为应对上述挑战，伦敦大学Emad Moeendarbary教授、William D. Richardson教授和诺丁汉大学Graham K. Sheridan教授合作，开发了一种基于水凝胶的可调谐微柱阵列系统。该系统通过在硅片上光刻制备模具，再利用聚丙烯酰胺水凝胶复模成型，构建出垂直排列的圆柱形微柱，用以模拟神经轴突的形态与力学特性。此平台能够独立且精确地调控模拟轴突的直径、间距及硬度，使其处于生理相关范围内，支持少突胶质细胞粘附、分化及多层髓鞘的形成，并结合荧光显微镜与转录组分析，为解析中枢神经系统髓鞘化机制及加速脱髓鞘疾病药物研发提供了高内涵、生理相关的高通量研究工具。相关论文以“Tunable hydrogel-based micropillar arrays for myelination studies”为题，发表在Nature Methods上。
研究首先展示了该水凝胶微柱阵列平台的构建与表征（图1）。通过标准光刻技术在硅片上精确刻蚀出不同直径与间距的微柱阵列模具，随后将聚丙烯酰胺前体溶液注入模具并聚合，即可在盖玻片上形成稳定的水凝胶微柱阵列。扫描电镜与共聚焦显微镜成像显示，水合状态下微柱直径约为设计尺寸的1.24倍，且通过调节丙烯酰胺与交联剂浓度，可制备出从超软（0.5 kPa）到硬（50 kPa）的系列微柱，精确覆盖了脑组织与轴突的生理硬度范围。该平台底部可粘附定制的PDMS小室，便于使用少量细胞和培养基进行长期培养。
图 1 | 用于髓鞘化研究的水凝胶微柱阵列的制备。 a, 使用微加工技术在洁净室内将微图案转移到硅片上。b, 通过紫外光将图案转移到涂有光刻胶的晶圆上，经显影和蚀刻，制得用于复制成型的母版。c, 在洁净室外，将PDMS间隔物置于图案区域周围，倒入聚丙烯酰胺溶液，真空脱气后加入TEMED引发聚合。将盖玻片置于顶部密封系统，聚合后从模具上剥离凝胶。d, 带有间隔物和聚丙烯酰胺溶液的硅片照片。比例尺，3 cm。e, 直径18 μm、间距15 μm、高度100 μm的微柱的SEM图像。f, 水合状态下FITC标记微柱（直径5 μm，间距10 μm，高度24 μm）的共聚焦图像。比例尺，50 μm。g, 与模具尺寸相比，微柱在PBS中的溶胀情况；数据为来自6个不同几何形状模具的均值±标准差。h, 最终细胞培养平台的示意图，PDMS小室包围凝胶，允许进行PDL、层粘连蛋白或纤连蛋白等蛋白包被。i, 组装好的微柱平台照片。比例尺，1 cm。j, 通过AFM测量的微柱硬度：0.5 kPa（超软）、5 kPa（软）、20 kPa（中等）和50 kPa（硬）；数据为均值±标准差，n = 3个凝胶，每个凝胶9次测量。a-c和h中的示意图使用Inkscape创建。
研究人员进一步验证了少突胶质细胞在该平台上的髓鞘形成能力（图2）。将纯化的O4⁺少突胶质细胞系细胞（即少突胶质细胞前体细胞，OPCs）接种于微柱阵列上，经过增殖、分化阶段，至第14天时可形成致密髓鞘。共聚焦显微镜结合三维重建清晰展现了髓鞘对微柱的同心圆包裹，并通过“包裹评分”进行量化。透射电镜成像更是直接证实了围绕微柱形成了多层且致密的髓鞘结构，其平均厚度为46±3 nm，平均约3.6层，且髓鞘层数与厚度呈强线性相关，表明该平台能高度模拟体内髓鞘的纳米级超微结构。
图 2 | 实验流程与多层髓鞘形成的验证。 a, 大鼠少突胶质细胞培养时间线。D，天。b, 使用正置共聚焦显微镜（25倍水浸物镜，数值孔径>0.95）对免疫染色样本进行成像，以获得大视野、良好分辨率的图像。c, 获取覆盖微柱高度（不包括凝胶基底）的Z轴层扫（步长2 μm），并处理为最大强度投影。比例尺，5 μm。d, 使用0.5 μm Z轴步长对5×5微柱区域进行高分辨率三维重建，用于精细分析髓鞘沉积。e, 包裹评分量化每个微柱的髓鞘覆盖程度（0-3分）。f, 完全包裹微柱（得分为3）数量除以视野中少突胶质细胞数量，计算每个少突胶质细胞完全包裹的微柱数。g-i, 三次独立实验的代表性图像：g, 少突胶质细胞包裹微柱的SEM图像（箭头表示包裹层）。比例尺，5 μm（左）和2 μm（右）。h, 围绕微柱的多层致密髓鞘的TEM图像（箭头表示髓鞘层）。比例尺，5 μm（左）和200 nm（右）。i, 微柱上髓鞘层（蓝色）与微柱自身（棕色）的高倍放大TEM图像。比例尺，200 nm。j, 通过TEM测量的髓鞘厚度（左）、层数（中）和髓鞘化微柱百分比（右）；数据为均值±标准误，n=16个视野（来自2次独立实验）。k, 髓鞘层数与厚度之间的线性相关性（n=16个视野，来自2次独立实验）。所有统计分析均采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（双侧），*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。具体P值见补充表1。
为探究地形与几何特征对髓鞘化的影响（图3），团队对比了在平面水凝胶与微柱阵列上培养的少突胶质细胞的转录组。结果显示，微柱阵列上调了与细胞外基质重塑、神经发生及细胞分化相关的基因，而下调了与细胞分裂相关的通路，表明三维地形结构本身即可促进少突胶质细胞分化成熟。通过系统地改变微柱直径（3、5、10 μm）与间距（5、10、15 μm），研究发现：对于较小直径的微柱（3和5 μm），增加柱间距（即降低密度）能提高完全包裹率；而直径10 μm的微柱则无论间距如何均表现出极高的完全包裹率（>70%）。更重要的是，g-比值（轴突直径与髓鞘外径之比）随微柱直径增加而增大（0.67至0.88），与体内大直径轴突更易被髓鞘化的特征一致，再次验证了平台对轴突几何特征的生理模拟。
图 3 | 几何特征对少突胶质细胞行为的影响。 a, 对培养在50 kPa微柱（直径5 μm，间距10 μm）与平面水凝胶上的大鼠少突胶质细胞进行RNA测序分析，识别出在表达上调（倍数变化>1，左）和下调（倍数变化<1，右）的差异表达基因中显著富集的GO条目。b, 热图显示了与平面水凝胶相比，微柱上少突胶质细胞培养物中，在OPCs和成熟少突胶质细胞中特异性表达的基因，特别是参与细胞骨架和脂质动力学以及细胞外基质粘附蛋白的基因的差异表达（倍数变化）和显著性（P值）。统计显著性通过Wald检验（双侧）评估，得到的P值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正（a,b）。c, 微柱母版，具有优化的16子阵列布局，可系统改变直径（3、5和10 μm）和间距（平面、5、10和15 μm）。比例尺，1 mm（左）和20 μm（右）。d, 培养2天（恢复期结束）后，细胞数相对于平面的倍数变化。数据来自3次重复实验的12个视野。e, 10×10微柱阵列的代表性最大强度投影图像，MBP免疫染色。比例尺，15 μm。f, 不同间距（中）和直径（右）下，具有相应包裹评分（0-3）的微柱百分比（左）和仅评分为3的微柱百分比。g, 对直径3、5和10 μm微柱（间距5 μm）上的髓鞘进行g-比值分析。比例尺，5 μm。数据为均值±标准误，来自两次重复实验的8个视野。所有统计均采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（双侧），*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。具体P值见补充表1。
研究还系统评估了细胞外基质的生物化学与生物力学特性对髓鞘化的综合影响（图4）。通过改变微柱硬度（0.5、5、50 kPa）和表面涂层（多聚-D-赖氨酸PDL、层粘连蛋白、纤连蛋白），发现硬度和涂层的作用依赖于微柱直径。对于5 μm微柱，过软的基底（0.5 kPa）会显著降低髓鞘化水平；而对于10 μm微柱，髓鞘化则随硬度增加而增强。生化方面，层粘连蛋白涂层能有效促进髓鞘形成，而纤连蛋白则增加了单个细胞完全包裹的微柱数量。当将硬度与涂层结合考察时，更硬的基底和层粘连蛋白涂层都能独立地增强髓鞘化效率，凸显了在体外模型中同时精确调控这两种因素的重要性。
图 4 | 生物化学和生物力学信号对少突胶质细胞分化与髓鞘化的影响。 a, 在不同硬度（0.5、5和50 kPa）和直径（5或10 μm）的微柱上培养7天的少突胶质细胞的代表性图像，MBP染色。比例尺，20 μm。b, 不同硬度和直径组合下，少突胶质细胞数量（左）、完全包裹微柱百分比（中）和每个细胞完全包裹微柱数量（右）的量化。c, 每种硬度和直径的包裹评分分布（0-3）。d, 在包被PDL、层粘连蛋白或纤连蛋白的微柱上培养的少突胶质细胞的代表性图像。比例尺，20 μm。e, 每种包被条件下，少突胶质细胞数量（左）、完全包裹微柱百分比（中）和每个细胞包裹微柱数量（右）的量化。f, 不同包被条件下的包裹评分分布（0-3）。g, 在不同硬度（超软-0.5 kPa；硬-50 kPa）和包被（PDL和PDL+层粘连蛋白）组合的微柱上培养的少突胶质细胞的代表性图像。比例尺，20 μm。h, 每种硬度和包被组合下，少突胶质细胞数量（左）、完全包裹微柱百分比（中）和每个细胞包裹微柱数量（右）的量化。i, 每种组合的包裹评分分布（0-3）。数据为均值±标准误，每种条件来自至少三个技术重复。所有统计均采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（双侧），*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。具体P值见补充表2。
鉴于平台在药物筛选中潜在的应用价值，研究团队测试了多种促髓鞘化药物（图5）。有趣的是，在模拟生理轴突硬度的软基底（5 kPa）上，苯托品和氯马斯汀等经典促髓鞘化药物促进髓鞘包裹的效应，相较于更硬的基底（20 kPa）有所减弱。这表明过于刚性的体外模型可能放大药物效应，导致假阳性结果。此外，在软基底上，此前临床效果不佳的GSK239512和辛伐他汀也能显著提升髓鞘包裹效率，而Wiskostatin则表现出剂量依赖性的抑制作用。这一发现强调了采用生理相关力学环境进行药物筛选的必要性，有助于更准确地评估候选化合物的真实疗效。
图 5 | 微柱测定法实现硬度依赖性化合物筛选。 a-c, 在软（5 kPa）和中等（20 kPa）硬度微柱上培养的少突胶质细胞，分别用DMSO、苯托品（1 μM）或氯马斯汀（10 μM）处理，MBP染色代表图像（a；比例尺，20 μm），并量化细胞数量（b，左）、完全包裹微柱百分比（得分3）（b，中）、标准化至DMSO的每个细胞包裹微柱数量的倍数变化（b，右）以及不同条件下的包裹评分分布（0-3）（c）。d-f, 在软（5 kPa）微柱上培养的少突胶质细胞，分别用DMSO、GSK239512（10 μM）或辛伐他汀（10 μM）处理，MBP染色（d；比例尺，20 μm），并按b和c中所述进行分析（e和f）。g-i, 在软（5 kPa）微柱上培养的少突胶质细胞，用增加浓度的Wiskostatin处理，MBP染色（g；比例尺，20 μm），并量化细胞数量（h，左）、完全包裹微柱百分比（h，中）、每个细胞包裹微柱数量（h，右）以及包裹评分分布（0-3）（i）。数据为均值±标准误，每种条件来自至少三个技术重复。所有统计均采用单因素方差分析与Tukey多重比较检验（双侧），*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。具体P值见补充表3。
最后，研究证明了该平台与人源少突胶质细胞的兼容性（图6）。无论是来自人胎儿的神经前体细胞，还是人胚胎干细胞诱导分化的少突胶质细胞，均能在微柱阵列上成功粘附、分化并形成髓鞘。共聚焦显微镜显示人源细胞形成复杂的突起网络，并包裹微柱；透射电镜进一步确认了人胚胎干细胞来源的少突胶质细胞在培养14天后，能够形成围绕微柱的致密多层髓鞘，首次在体外实现了人源细胞在具有生理相关硬度的三维轴突模拟物上形成致密髓鞘，为研究人类特异的髓鞘化过程及疾病模型提供了极具转化价值的平台。
图 6 | 人源少突胶质细胞在微柱上髓鞘化的验证。 a-e, 在微柱上培养的人胎儿少突胶质细胞：人胎儿OPC培养的示意图和时间线（a）；培养9天后，人胎儿少突胶质细胞包裹微柱的最大Z轴强度投影图像（青色为Hoechst染色的细胞核，绿色为FITC标记的微柱，黄色为MBP）（比例尺，20 μm）（b）；每视野（15×15微柱）的平均细胞计数（c）；完全包裹微柱（得分3）的百分比（左）、每个细胞完全包裹微柱（得分3）的数量（中）以及包裹评分为0-3的微柱百分比（右）（数据为均值±标准误，n=3个视野）（d）；培养14天后，人胎儿少突胶质细胞包裹微柱的TEM图像（比例尺，5 μm（左），500 nm（中）和200 nm（右））（e）。f-k, 在微柱上培养的人胚胎干细胞（hPS）来源的少突胶质细胞：人PS细胞来源OL的培养示意图和时间线（f）；培养9天后，人PS细胞来源少突胶质细胞包裹微柱的最大Z轴强度投影图像（青色为Hoechst染色的细胞核，绿色为FITC标记的微柱，黄色为MBP）（比例尺，20 μm）（g）；每视野（15×15微柱）的平均细胞计数（h）；完全包裹微柱（得分3）的百分比（左）和每个细胞完全包裹微柱（得分3）的数量（右）（数据为均值±标准误，n=3个视野）（i）；培养9天后，人PS细胞来源少突胶质细胞包裹微柱的SEM图像（比例尺，20 μm（左）和5 μm（右））（j）；培养14天后，人PS细胞来源少突胶质细胞形成的多层致密髓鞘的TEM图像（比例尺，5 μm（左）和200 nm（右））（k）。
综上所述，该研究开发的仿生水凝胶微柱阵列平台，通过整合生理相关的生物力学与物理参数复制、超微结构验证、人源细胞兼容性、转录组学洞察以及广泛的实验可及性五大关键能力，显著推进了中枢神经系统髓鞘化体外建模的发展。该平台不仅揭示了生物物理微环境在塑造髓鞘形成中的关键作用，更通过区分真实的药物效应与硬度驱动的假象，提高了药物筛选的预测价值。其可扩展性、可重复性及与标准制造技术的兼容性，使其在基础研究和转化医学领域具有广泛应用前景。未来，结合患者来源的诱导多能干细胞，该平台有望用于疾病特异性髓鞘病变建模，并为多发性硬化等脱髓鞘疾病实现个性化治疗药物筛选，为精准医学提供强有力的工具。
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