关于金鸡纳霜（奎宁，又名金鸡纳碱）这种初代抗疟疾神药，网上有几则流传甚广的小故事。清康熙三十二年（1693年）五月，康熙帝患上了疟疾，高烧不退，御医束手无策，后来在京的法国传教士进献了金鸡纳霜，疗效甚佳，皇帝性命得以保全。此后，康熙五十一年（1712年）七月，曹寅（曹雪芹祖父）染上疟疾，他向康熙帝讨要以曹家之富也无法搞到的金鸡纳霜，康熙帝不但立刻应允，还“恐迟延，所以赐驿马星夜赶去”，他叮嘱曹寅“若不是疟疾，此药用不得，须要认真。”可惜曹寅实在运气不佳，没有等到神药，就不治而亡。
金鸡纳树的花与干树皮。图片来源于网络
不论故事的真实性有几何，以奎宁（quinine，1a）为代表的金鸡纳生物碱确确实实是一类具有重要临床应用价值的天然产物，人类使用长达数百年，对这类天然产物的研究也超过两百五十年。奎宁之外，奎尼丁（quinidine，2a）是重要的抗心律失常药物，而辛可尼丁1（cinchonidine）和辛可宁2（cinchonine）则广泛用作不对称合成中的手性催化剂。有趣的是，这些生物碱的二氢类似物（如：氢化辛可宁丁（1′）、氢化辛可宁（2′）、氢化奎宁（1a′）、氢化奎尼丁（2a′））也可通过植物分离，并显示出与奎宁、奎尼丁相仿的性质。尽管这些化合物的化学结构早已明确，但其在植物中的生物合成途径却长期未被揭示。从生物合成的角度来看，金鸡纳生物碱属于单萜吲哚生物碱，理论上由色胺3（tryptamine）和裂环马钱子苷4（secologanin）经异胡豆苷合酶（STR）催化生成异胡豆苷5（strictosidine），再经酶解脱糖后在还原酶和酯酶的作用下形成dihydrocorynantheal（6'）。植物喂养研究表明6'和corynantheal（6）同系物都经过一系列未知步骤平行转化并形成假设的吲哚-奎宁环中间体辛可胺（7）和二氢辛可胺（7'），这些中间体再通过一系列未知的化学转化形成1、1'、2和2'的喹啉核心骨架。另外，喂养研究已证实甲氧基化同系物的生物合成是通过与1和2相同的方式进行，即使用5-甲氧基色胺（3a'）代替3作为吲哚起始前体（图1）。虽然获得了一些进展，但corynantheal骨架如何转化为这些生物碱的机制仍是未解之谜。
近日，德国马克斯-普朗克化学生态学研究所的Sarah E. O’Connor教授和美国佐治亚大学的C. Robin Buell教授课题组系统地揭示了从corynantheal到最终金鸡纳生物碱（包括其二氢和甲氧基化衍生物）的完整生物合成途径，鉴定了所有关键中间体，克隆了所有负责这些转化的酶基因，并进行了功能表征。该研究并未依赖单一技术，而是创造性地整合了经典与前沿的研究方法，形成了一套强大的“组合拳”，具体而言：1）同位素标记与喂养实验确认了“on-pathway”中间体；2）病毒诱导的基因沉默（VIGS）在植物体内验证候选基因的功能；3）单细胞核RNA测序获得高分辨率的细胞类型特异性基因表达谱，精确定位生物合成基因活跃的细胞区域，并用于候选基因筛选；4）比较转录组学，跨物种（金鸡纳、大叶蛇根草、帽蕊木）比较，识别保守的生物合成基因；5）蛋白质组学与酶活性分级分离，从植物粗提物中寻找催化活性并通过质谱鉴定相关蛋白；6）异源表达与酶学表征，在本氏烟草中瞬时表达候选基因，或在大肠杆菌/酵母中纯化蛋白进行体外功能验证。相关成果发表在Nature上。
图1. 金鸡纳生物碱的可能生物合成途径。图片来源：Nature
早期的实验表明当将6加入金鸡纳的细胞培养物中时会迅速被还原为相应的corynantheol（11）。为此，作者化学合成了同位素标记的类似物d5-corynantheol（11b）并将其饲喂于金鸡纳植物组织，液相色谱-质谱（LC-MS）成功检测到下游产物d5-cinchonidine（1b）、d5-cinchonine（2b）和d5-cinchonamine（10b），进而证实11是一种“on-pathway”中间体（图2a-c）。其次，作者还检测到11b的同位素有效掺入到一种未知代谢产物中（图2d），通过饲养、LC-MS分析、大规模分离、半合成以及NMR分析证实其为一种全新的季铵化合物并将其命名为chinonium（12，图2e）。进一步饲喂实验表明12可转化为cinchonaminal（7），后者在植物中主要以环化形式cyclocinchonaminal（13）存在（图2f、2g）。总之，这三个中间体（11、12、13）的发现为重新构建金鸡纳生物碱的合成途径提供了关键节点。
图2. 通过饲喂实验鉴定三种关键的中间体（11–13）。图片来源：Nature
随后，作者通过共表达分析筛选出30个候选转移酶并在本氏烟草中瞬时表达，发现一个BAHD家族酰基转移酶可将11转化为malonyl-corynantheol（14）。体外实验证实该酶使用malonyl-CoA作为酰基供体，并将其命名为O-malonyltransferase（MAT）。此外，作者还通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）来评估MAT在体内的功能，结果显示在沉默MAT后，corynantheol及其衍生物在金鸡纳树叶中大量积累，这证明MAT在体内确实参与该反应（图3a）。其次，作者通过整合单核RNA测序、蛋白质组学分析和比较转录组学筛选出20个候选基因（图3c-3f），最终发现另一个BAHD酰基转移酶家族（即malonyl-corynantheol cyclase（MCC））能够催化malonyl-corynantheol的环化反应并生成12（图3g、3h），而且该反应不依赖辅因子，具有严格的底物特异性，仅识别malonylated底物。值得注意的是，尽管MAT和MCC同属BAHD酰基转移酶家族，但是序列相似性仅19.5%，并且MCC已丧失酰基转移酶活性，进化出新的环化功能，这一发现拓宽了BAHD酰基转移酶家族的功能谱。紧接着，作者鉴定出一种2-酮戊二酸依赖性双加氧酶并将其命名为Cinchonaminal synthase（CiS），其能将12转化为cinchonaminal（7）。CiS在本氏烟草中表达后可催化12生成13，但同时也生成过氧化产物cinchonaminal acid（15），这表明其活性需被下游酶迅速“捕获”。CiS产物被进一步还原得到cinchonamine（10），该反应由一种醇脱氢酶Cinchonaminal reductase（CiR）催化。需要指出的是，CiR与CiS在单核RNA测序中呈现共表达模式且在细胞类型上均富集于表皮细胞。进一步发现一个CYP71家族的细胞色素P450酶cinchonaminal oxidase（CiO）能够催化cinchonaminal的吲哚氧化开环并重排为喹啉结构，从而生成cinchonidinone（8）和cinchoninone（9），这是整个途径中形成喹啉环的关键步骤。VIGS沉默CiO后，13和10显著积累，而8和9显著减少，证实了其在体内的功能。金鸡纳生物碱生物合成的最后一步涉及将8/9还原为最终产物1/2，作者鉴定出一种aldo-keto还原酶Keto-reductase（KR4），后者KR4在体外表现出良好的还原活性，但在本氏烟草中未能检测到活性。进一步研究发现本氏烟草提取物中含有抑制KR4活性的因子，从而解释了异源系统中还原步骤缺失的原因。
图3. MCC 的发现与功能鉴定。图片来源：Nature
有了这些被鉴定和功能表征的酶，金鸡纳生物碱生物合成途径可以在异源宿主本氏烟中重构。具体来说，将广为人知的中心单萜吲哚生物碱前体5作为底物外源供给本氏烟叶片，这些叶片已经用DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO以及一个编码来自系统发育相关植物长春花的异胡豆苷β-葡萄糖苷酶（CrSGD）的构建体进行了转化。正如预期的那样，异胡豆苷被有效地转化为8'和9'。改用甲氧基化类似物10-OMe异胡豆苷（5a）则导致形成8a'和9a'，这一结果证实了下游酶的底物灵活性，并为先前提出的甲氧基化生物碱的平行生物合成途径提供了明确的实验支持。值得注意的是，将STR、T5H、OMT1和液泡异胡豆苷转运蛋白STTr加入基因堆叠，并用3和4替换5，导致了甲氧基化和非甲氧基化酮式喹啉的混合物形成，进而模拟了这些二氢生物碱在金鸡纳树中的存在情况（图4a）。由于在这些测定条件下，DCS导致形成6'，因此作者测试了合成11作为外源底物用于本氏烟叶盘以观察8和9的形成（图4b）。此外，在本研究开始时鉴定的中间体11、12和13，在对这些转化的本氏烟叶片进行分析时被检测到。相比之下，当MAT下游的酶（MCC、CiS和CiO）存在时，14是检测不到的，这一结果与天然金鸡纳树代谢物谱中缺乏这种瞬时中间体相一致。总的来说，这些发现凸显了使用这些生物合成基因进行药用相关喹啉生物碱生物合成的潜力。
图4. 喹啉金鸡纳生物碱的生物合成。图片来源：Nature
定向生物合成是一种已使用数十年的方法，用于生产工业上重要的天然产物类似物，该方法向生成产物的宿主提供外源非天然起始底物。然而，为了成功生产最终产物类似物，这种方法要求所有下游酶都能催化所有相应非天然生物合成中间体的转化。由于金鸡纳生物合成酶天然地作用于甲氧基和二氢衍生物，因此作者推断这些生物合成酶将非常适合用于生产非天然生物碱类似物。事实上，将转化了STR、CrSGD、DCS、DCE、MAT、MCC、CiS和CiO的本氏烟叶片渗入一系列3的类似物（如：5-氟色胺、5-氯色胺、6-氟色胺、6-氯色胺、7-氟色胺和7-氯色胺）以及天然辅底物4，发现在所有情况下都观察到卤代色胺底物被消耗，同时存在质量数和MS/MS模式与形成相应二氢辛可宁酮和二氢辛可尼酮类似物一致的化合物（图5），这些结果表明鉴定的生物合成基因可用于生产卤代的金鸡纳生物碱类似物，考虑到卤代喹啉的临床用途和吸引力，这些类似物可能对药物化学应用有重要价值。
图5. 喹啉金鸡纳生物碱卤代类似物的生物合成。图片来源：Nature
总结
本文报道了负责金鸡纳生物碱独特的喹啉-奎宁环骨架生物合成的基因，同位素标记、基因沉默、单核RNA测序和比较转录组学的结合揭示了几个意想不到的生物合成转化过程。作者还描述了一种以前未被报道的季铵盐中间体，它通过一种不寻常的酶促环化反应生成。这些发现解开了数百年来关于金鸡纳生物碱骨架如何生物合成的谜团，并凸显了通过代谢工程方法获取这些化合物的前景，也为金鸡纳生物碱的绿色可持续生产和基于合成生物学的药物研发开辟了全新的道路。
Biosynthesis of cinchona alkaloids
Blaise Kimbadi Lombe, Tingan Zhou, Gyumin Kang, Joshua C. Wood, John P. Hamilton, Klaus Gase, Yoko Nakamura, Ryan M. Alam, Ron P. Dirks, Lorenzo Caputi, C. Robin Buell, Sarah E. O’Connor
Nature,2026, DOI: 10.1038/s41586-026-10227-x
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