好消息：博士读完了，基金本子写完了。
坏消息：头发没熬过它们，提前提交了‘离职申请’。
以前觉得‘聪明绝顶’是个夸张的修辞，现在才知道，这是学术圈最写实的毕业要求。
毛发变白治疗困境亟待突破
白发是人类衰老的显著标志之一，但其背后隐藏着复杂的生物学机制。毛发变白直接源于毛囊中功能性黑色素细胞的不足和黑色素生成能力的下降。白癜风、早发性白发、桥本甲状腺炎等色素性疾病影响着全球0.5%至2%的人口，给患者带来心理和生理上的双重负担。然而，由于毛囊黑色素细胞位于皮肤深层的真皮层，现有的大分子药物经皮递送效率极低，而口服或静脉注射对皮肤及皮肤附属器疾病效果有限。传统的透皮促渗剂会破坏皮肤屏障功能并引起刺激，微针技术虽能穿透角质层，但频繁使用会造成皮肤损伤。因此，开发高效、安全的生物大分子经皮递送系统成为治疗毛发变白的关键瓶颈。
白头发终于有救了
针对这一挑战，上海交通大学金鑫副研究员、朱新远教授团队设计了一种基于聚合酪氨酸酶纳米胶囊的透皮治疗方案，可直接激活局部黑色素细胞并原位刺激黑色素生成。研究团队通过优化纳米胶囊的尺寸和表面电位，显著增强了皮肤渗透性并保持了酶活性。nTYRs能够高效地将活性酪氨酸酶通过角质层递送至毛囊黑色素细胞，在小鼠和人类黑色素细胞模型、猪和人类皮肤模型中均实现了快速而显著的毛发复色。研究还建立了一种免疫介导的内源性白发小鼠模型，更真实地模拟了人类病理生理过程。相关论文以“Direct Activation of Follicular Melanocytes by Polymeric Tyrosinase Nanocapsules for Reversing Hair Graying”为题，发表在ACS Nano上。
示意图1. 经皮递送的 nTYRs 通过促进原位黑色素生成，诱导毛发变白疾病中的毛发复色。
图1. 经皮递送纳米胶囊的合成与表征。(a) 经皮递送纳米胶囊通过原位聚合法制备。以丙烯酰胺（AM）为单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）为交联剂，通过原位聚合合成蛋白纳米胶囊，得到以蛋白为核、PAM为聚合物壳层的纳米胶囊。聚合物壳层的表面特性可通过调节单体比例和聚合时间进行定制。(b) 天然蛋白及具有负Zeta电位的纳米胶囊的动态光散射结果。(c) 天然蛋白及不同尺寸纳米胶囊的透射电镜图像。(d) 天然蛋白及不同尺寸纳米胶囊的Zeta电位。数据表示为三次独立实验的均值±标准误。
研究团队首先系统探究了纳米胶囊的透皮促渗机制。他们以白蛋白和聚丙烯酰胺为模型，合成了尺寸在20至200纳米、表面电位在-10 mV至+20 mV范围内的一系列纳米胶囊。动态光散射和透射电子显微镜表征显示，天然蛋白的直径约为6纳米，而纳米胶囊的直径可从约20纳米调控至200纳米以上。通过添加带氨基的阳离子单体，团队成功调节了纳米胶囊的表面电位。体外透皮实验采用与人类皮肤结构高度相似的猪皮肤模型，结果发现：所有200纳米以下的纳米胶囊均显示出比天然蛋白显著增加的渗透深度，24小时后可穿过整个表皮甚至到达真皮层。值得注意的是，在相同尺寸下，带正电位的纳米胶囊表现出更优异的促渗效果，能够更深入地进入真皮层。其中，50纳米的带正电纳米胶囊在真皮层的相对积累量达到25.78%，是唯一在该深度积累比例超过25%的组别。傅里叶变换红外光谱分析显示，正电性纳米胶囊处理降低了角质层中脂质对应的吸收峰强度，表明其通过破坏脂质双层结构、形成水性通道来协助纳米胶囊运输。基于尺寸和表面电位这两个关键因素，研究团队建立了预测纳米胶囊渗透系数的数学模型，该模型能够根据纳米胶囊的zeta电位、直径和壳层材料参数预测其24小时的渗透深度，为后续系统设计提供了理论指导。
图2. 纳米胶囊的体外渗透性。(a) FITC标记纳米胶囊渗透1、4、24小时后皮肤的共聚焦图像。(b) 不同尺寸和Zeta电位纳米胶囊的渗透深度。(c) 沿渗透路径0-200 μm范围内纳米胶囊的相对蓄积值。(d) 纳米胶囊沿渗透路径的相对蓄积分布比例。(e) 经水、天然蛋白、NCs-20+、NCs-50+、NCs-100+、NCs-150+和NCs-200+处理24小时后角质层脂质含量的FT-IR光谱。(f) 具有不同表面特性和尺寸的纳米胶囊在猪皮肤上表现出不同的渗透性。(g) 不同纳米胶囊处理后皮肤的相对脂质含量。(h,i) 具有负或正Zeta电位、尺寸小于250 nm的纳米胶囊在24小时的渗透深度实验数据与预测数据。
在确定了最佳透皮参数后，团队合成了不同尺寸的带正电酪氨酸酶纳米胶囊。酶活性测试显示，nTYR-20+和nTYR-50+的活性损失小于10%，而nTYR-100+的活性损失超过75%，nTYR-150+和nTYR-200+几乎完全失活。这归因于过厚的聚合物壳层阻碍了底物向酶活性中心的传输。在稳定性方面，天然酪氨酸酶在60°C孵育0.5小时后活性损失超过86%，1小时后几乎完全失活；而nTYR-20+和nTYR-50+在40°C处理1小时后活性损失小于20%，60°C处理1小时后损失小于60%。针对皮肤pH值从4到8的变化，nTYRs在不同pH环境下均表现出更稳定的活性，尤其是在碱性条件下。综合催化活性、渗透性和制备成本，研究团队选择nTYR-20+进行后续研究。
图3. 不同尺寸nTYRs在不同条件下的酶活性。(a) DLS测量的TYR和nTYRs的尺寸。(b) 不同尺寸nTYRs在聚合物壳层制备后的酶活性保留率。(c) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在40°C或60°C加热处理0.5或1小时后的活性保留率。(d) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在不同pH环境下的稳定性。
为验证nTYRs的安全性，团队在五种细胞系上进行了细胞毒性测试，包括人角质形成细胞、成纤维细胞以及三种黑色素细胞。结果显示，TYR和nTYR处理48小时后的细胞毒性均在可接受范围内。流式细胞术结果表明，nTYRs在2小时内被黑色素细胞摄取，且由于正电荷表面特性，nTYR组的荧光强度更高。共聚焦显微镜观察发现，nTYR处理后，黑色素细胞的树突数量显著增加，树突长度明显增长，并出现二级或三级分支——这在PIG3 V细胞中尤为突出，nTYR组的平均树突长度是PBS组的1.94倍。黑色素颗粒的观察和定量分析证实，nTYR组细胞内黑色素颗粒聚集体显著更多、更大。在正常黑色素细胞中，nTYR组的黑色素颗粒相对量是TYR组的1.8倍。总体黑色素含量评估显示，nTYRs的促黑色素生成能力优于TYRs：在正常黑色素细胞中，nTYRs比PBS组增加了14%以上的黑色素含量；在白癜风细胞PIG3 V中，这一增幅高达22.3%。与经典酪氨酸酶激活剂8-甲氧基补骨脂素相比，nTYRs在PIG1细胞中的促黑色素生成因子达到了3.72，而TYR仅为2.33。
图4. nTYRs的促黑色素生成能力。(a) nTYRs通过增强局部黑素细胞的黑色素生成和黑色素小体转运来促进原位色素沉着。(b-f) 8-MOP、TYR和nTYR在5种不同细胞（HaCaT细胞、L929细胞、HEM细胞、PIG1细胞和PIG3 V细胞）上的细胞毒性。(g,h) HEM细胞和PIG3 V细胞对TYRs和nTYRs的摄取。(i) 经PBS、TYRs和nTYRs处理后3种不同黑素细胞的共聚焦图像。(j-l) 经PBS、TYRs和nTYRs处理后3种不同黑素细胞中黑色素颗粒的相对数量。(m-o) 3种不同黑素细胞树突相对长度的统计结果。(p-r) 3种不同黑素细胞中黑色素增加率及与8-MOP相比的促进因子。
透皮渗透实验进一步证实，nTYRs比TYRs具有更深的皮肤渗透能力，能够到达真皮层。在三维人表皮模型EpiKuits上，nTYRs处理24小时后可到达表皮模型底部，而TYR的荧光信号主要停留在模型上层。三维人黑色素皮肤模型MelaKuits的结果进一步确认了nTYRs的透皮渗透性和促黑色素生成能力。
图5. nTYR的经皮渗透性。(a-c) FITC标记的TYR和nTYR在猪皮肤中渗透1、4和24小时后的分布。(d) FITC标记的TYR和nTYR在EpiKuits模型中渗透24小时后的分布。
研究团队随后在白发小鼠模型中验证了nTYRs诱导毛发复色的疗效。他们利用B16F10黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠背部诱导局部CD8+ T细胞过表达，建立了模拟人类白发患者毛囊周围微环境的内源性白发模型。经过20天的局部给药，nTYRs处理组小鼠皮肤的角质层保持了与对照组相同的微形态特征，表皮厚度和皮肤厚度变化可忽略不计，且未显示任何全身毒性迹象。新生毛发的超景深显微镜观察显示，nTYR组出现了更明显的深色毛发，表明nTYR对毛囊色素沉着的影响不仅体现在毛干上，也体现在新生毛发的深色尖端。通过对背部给药区域进行分区定量分析，nTYR组在脱色面积扩展和色差增加方面均表现出明显的缓解效果，尤其在远离手术区域的第3区，nTYRs对脱色扩散的缓解趋势更为显著。组织学分析显示，nTYRs促进了毛囊生长，毛囊数量增加了73.4%，毛囊长度增加了90.5%。黑色素染色结果显示，nTYR组毛囊中的毛干出现了明显的色素沉着。
图6. 基于nTYR的治疗对毛发变白小鼠逆转毛发变白和诱导复色的效果。(a) 实验设计示意图。(b,d) 阴性对照组、未处理对照组、PBS组和nTYR组从毛发变白早期到进展期剃毛区域的脱色情况。(c) 小鼠背部剃毛的超景深显微镜照片。(e) 剃毛区域分区示意图。(fg) 各组脱色色差和面积比的分区及整体统计。
与临床白癜风药物鲁索替尼及天然酪氨酸酶的对比研究显示，尽管鲁索替尼减少了毛囊周围的CD8+ T细胞积聚，但黑色素细胞的保留仍然不足；而nTYR组则表现出更好的黑色素细胞保留。在脱色面积扩散和色差增加的缓解能力上，nTYRs均显著优于鲁索替尼和天然TYR。nTYR组的平均色差变化为5.87，仅为TYR组的30.2%。TYR组较弱的脱色缓解效果可能归因于其经皮递送效率低、细胞摄取能力差以及酶活性损失。此外，由于活动性白癜风患者体内存在酪氨酸酶抗体，TYR可能被识别和清除。相比之下，nTYRs即使在CD8+ T细胞攻击未被抑制的情况下，仍显示出激活存活休眠黑色素细胞的潜力。
图7. nTYR组与芦可替尼组、nTYR组与TYR组的复色效果比较。(a) 各组小鼠皮肤H&E染色和Masson-Fontana染色图像。(b,c) 未处理对照组、PBS组、芦可替尼组、TYR组和nTYR组的脱色色差和面积比。(d,e) 未处理对照组、PBS组、芦可替尼组、TYR组和nTYR组的毛囊数量和长度。(f) nTYR组小鼠皮肤Masson-Fontana染色放大图像。(g) PBS组、芦可替尼组、TYR组和nTYR组小鼠皮肤中CD8+ T细胞和黑素细胞的免疫荧光图像。
本研究开发的高效经皮递送酪氨酸酶纳米系统为直接治疗毛发变白提供了有前景的新策略。nTYRs对黑色素细胞的激活机制值得进一步深入研究，该策略不仅有望用于毛囊复色，还可拓展至更广泛的皮肤复色场景，如白癜风。值得注意的是，尽管nTYRs不靶向黑色素细胞功能障碍的上游发病机制，但其直接的促黑色素生成能力和黑色素细胞激活效应与现有疗法并不冲突，具有良好的协同应用潜力。此外，该纳米载体系统及建立的渗透模型为基于纳米胶囊和纳米凝胶的经皮药物递送提供了新的理论描述，其应用可超越毛发变白，拓展至其他皮肤疾病的生物大分子经皮递送。面向临床转化，壳层材料的设计需根据蛋白质载货要求、目标渗透深度和体内生物降解行为进行定制，未来的材料选择应在生物安全性和组装兼容性之间取得平衡，以优化转化潜力。
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