Redox Biol I 天然异黄酮破解心肌肥厚：鸢尾黄素阻断MCL1泛素化，重塑线粒体稳态 (陈晓强/李穗吉-厦门大学附属心血管病医院)|介导|异黄酮|心肌肥厚|心血管病医院|李穗吉|线粒体|细胞|蛋白|陈晓强|鸢尾黄素

2025年9月2日，厦门大学附属心血管病医院/厦门大学医学院陈晓强、李穗吉团队联合上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院蔡利栋、杨文艺团队，在Redox Biology（中科院1区，IF=11.9）在线发表题为 “Tectorigenin attenuates cardiac hypertrophy via USP9X/MCL1-mediated mitochondrial stabilization” 的研究论文。该研究聚焦病理性心肌肥厚及其向心力衰竭进展这一心血管疾病关键问题，围绕天然异黄酮类化合物鸢尾黄素（Tectorigenin，Tec）改善心肌肥厚、线粒体功能障碍和心脏病理性重构的作用及机制展开系统研究。

研究团队采用横主动脉缩窄术（TAC）构建压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型，并结合苯肾上腺素（PE）诱导的新生大鼠心肌细胞肥大模型，从体内外两个层面验证 Tec 的心脏保护作用。结果显示，Tec 可显著提高 TAC 小鼠生存率，改善左心室射血分数和短轴缩短率，降低心脏和肺组织负荷，减轻心肌细胞肥大、心肌纤维化及病理性重构，并下调 ANP、BNP、α-SMA、Col1α 和 CTGF 等肥厚/纤维化相关标志物。

机制上，该研究发现，Tec 的核心保护作用并非依赖传统 PI3K-AKT 存活信号通路，而是通过稳定 MCL1 这一线粒体完整性关键调控因子发挥作用。肥厚刺激会促进 MCL1 泛素化及蛋白酶体降解，导致线粒体结构破坏、氧化应激增强和能量代谢障碍；Tec 则可通过增强去泛素化酶 USP9X 与 MCL1 的相互作用，减少 MCL1 泛素化降解，维持 MCL1 蛋白稳定。

进一步研究显示，Tec 可保护线粒体超微结构，减少线粒体碎片化和肿胀，恢复线粒体嵴完整性，提高线粒体复合物 I–V 活性、ATP 生成能力和氧耗水平，同时降低 ROS 水平并增强 SOD、MnSOD、GSH/GSSG 等抗氧化防御。无论在体外心肌细胞还是体内 TAC 小鼠中，敲低 MCL1 或 USP9X 均会削弱甚至消除 Tec 的抗心肌肥厚、抗氧化和线粒体保护效应，证明 USP9X-MCL1-线粒体稳态轴是 Tec 发挥心脏保护作用的关键通路。

该研究系统阐明了鸢尾黄素通过 “增强 USP9X-MCL1 相互作用—抑制 MCL1 泛素化降解—稳定线粒体功能—阻断心肌肥厚与纤维化重构” 改善病理性心肌肥厚的新机制，为天然活性成分干预心肌肥厚及心力衰竭提供了新的实验依据，也为开发靶向线粒体稳态和蛋白去泛素化调控的心血管疾病治疗策略提供了重要参考。

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【摘要】

病理性心肌肥厚由线粒体功能障碍和适应不良性心脏重构驱动，目前仍是治疗上的重要挑战。本研究探讨了鸢尾黄素（tectorigenin，Tec）在横主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）诱导心肌肥厚中的心脏保护作用，并重点关注其对线粒体稳态的影响。

在动物模型中，Tec 给药可提高 TAC 小鼠生存率，改善心功能障碍，减轻心肌肥厚和纤维化，并保护线粒体功能。体外实验显示，Tec 可抑制苯肾上腺素（phenylephrine，PE）诱导的心肌细胞增大和线粒体损伤。

机制研究表明，Tec 可通过 USP9X 促进 MCL1 去泛素化，从而稳定 MCL1 这一线粒体完整性关键调控因子，防止其降解，并且该作用不依赖 PI3K-AKT 信号通路。值得注意的是，沉默 MCL1 或 USP9X 均可抵消 Tec 的抗心肌肥厚和抗氧化作用，说明二者在 Tec 发挥保护作用过程中具有关键作用。

这些发现表明，Tec 是一种新的 USP9X-MCL1-线粒体轴调节因子，为将病理性心脏重构与线粒体功能障碍分离提供了新的治疗思路。通过绕开传统细胞存活通路，Tec 代表了一种以线粒体为核心的策略，可延缓心力衰竭进展，并将天然化合物药理学与靶向细胞器稳态调控相联系。

关键词：病理性心肌肥厚；线粒体功能障碍；鸢尾黄素；MCL1；泛素化

研究背景及科学问题

心肌肥厚最初是机体对长期压力负荷的一种适应性反应，但随后可能发展为病理性重构和心力衰竭，是全球发病率和死亡率的重要贡献因素。该病理过程以心肌细胞增大和组织结构改变为主要特征，最终导致心功能受损，并增加严重心血管事件风险。

尽管目前在心肌肥厚治疗方面已有一定进展，例如使用血管紧张素转换酶抑制剂和 β 受体阻滞剂等，但现有治疗仍难以有效逆转病理性心脏重构，也无法充分干预其深层机制。现有疗法疗效有限且存在一定副作用，因此亟需开发新的干预策略，尤其是能够恢复心脏稳态的靶向药物。

线粒体在心脏能量产生中发挥核心作用，其功能障碍已被认为是病理性心肌肥厚的关键因素。线粒体约占心肌细胞体积的 30%，是通过氧化磷酸化产生 ATP 的主要场所，对维持心肌收缩功能至关重要。同时，线粒体还参与钙稳态调节、氧化还原平衡维持和细胞凋亡控制，这些过程均对心脏健康十分重要。

在病理性心肌肥厚过程中，线粒体结构、能量生成和动力学均会发生明显紊乱，包括线粒体网络碎片化、ATP 合成减少和活性氧（ROS）生成增加。这些改变共同加重心肌损伤，并加速心力衰竭进展。尽管改善线粒体质量控制的策略，如增强线粒体自噬或调节线粒体融合/分裂过程，已显示一定潜力，但连接线粒体功能障碍与心肌肥厚进展的确切机制仍未完全明确。

鸢尾黄素（Tectorigenin，Tec）是一种来源于植物的天然异黄酮，因具有多种生物活性而受到关注，包括抗氧化、抗炎和心脏保护作用。在心血管领域，Tec 已被报道可改善内皮功能、降低氧化应激并抑制心脏纤维化。近期研究提示，Tec 可能通过调节线粒体功能发挥保护作用，例如稳定线粒体膜电位、减少 ROS 生成和改善代谢紊乱。然而，Tec 在病理性心肌肥厚中的具体作用及其靶向线粒体的机制尚未得到充分研究。

PI3K-AKT 通路长期以来被认为在心脏中具有促进细胞存活和参与病理性信号转导的双重作用，尤其在心肌肥厚背景下，其作用可能因具体环境而异。近期研究强调，MCL1 是 PI3K-AKT 通路下游的重要效应因子，也是连接线粒体动力学、代谢适应和心肌肥厚的关键节点。

MCL1 是 BCL-2 蛋白家族中的抗凋亡成员，在维持线粒体完整性方面发挥重要作用。其作用包括稳定线粒体膜电位以增强 ATP 合成、与线粒体分裂和融合调控因子协作调节线粒体动力学、通过线粒体自噬降解通路促进选择性线粒体更新等。在心脏疾病中，MCL1 缺失会破坏线粒体完整性和功能，导致能量代谢紊乱并加重肥厚性重构，说明其对维持心肌细胞健康具有关键意义。

鉴于 Tec 具有潜在心脏保护作用，本研究进一步探讨 Tec 是否能够通过影响 MCL1 及其对线粒体功能的调控来减轻病理性心肌肥厚。这一研究不仅有助于阐明 Tec 的作用机制，也可能为在心脏重构过程中保护线粒体健康提供新的治疗策略。

本研究以 TAC 诱导的心肌肥厚为模型，重点探讨 Tec 的治疗效果及其与 MCL1 稳定性和线粒体功能维持之间的关系。研究结果显示，Tec 可通过保护线粒体健康、恢复 ROS 平衡、降低心肌肥厚标志物表达来改善心脏病理改变。机制上，Tec 通过 USP9X 介导的去泛素化过程增强 MCL1 稳定性，并且这一过程独立于传统 PI3K-AKT 信号通路。上述发现提示，Tec 是一种有前景的线粒体功能障碍靶向干预候选物，并揭示 USP9X-MCL1 轴可能成为治疗心肌肥厚的新策略。

重要发现及亮点

1. Tec 改善 TAC 诱导心肌肥厚小鼠的心功能障碍和病理性重构

研究首先选择具有富含羟基结构的小分子化合物 Tec 进行药理学评价。为探索 Tec 治疗病理性心肌肥厚的潜力，研究建立 TAC 小鼠模型，并给予 Tec 75 mg/kg 口服给药，每两天一次，持续 4 周。该剂量此前已在小鼠系统中验证具有安全性。

结果显示，与未治疗 TAC 小鼠相比，Tec 干预显著提高 TAC 小鼠生存率。超声心动图分析显示，TAC 手术导致小鼠心功能明显恶化，而 Tec 治疗小鼠心功能得到明显保护，表现为左心室射血分数（LVEF）升高、左心室短轴缩短率（LVFS）改善，同时左心室收缩末期内径（LVIDs）和舒张末期内径（LVIDd）降低。

此外，大体形态分析显示，与 TAC 对照组相比，Tec 处理小鼠心脏和肺组织体积减少，心重/胫骨长度比（HW/TL）和肺重/胫骨长度比（LW/TL）显著降低。HE 染色进一步证实，与 TAC 小鼠相比，Tec 干预组左心室腔扩张和病理性心肌重构明显减轻。整体而言，这些结果表明 Tec 给药可有效缓解 TAC 诱导的心功能障碍，并提高小鼠生存率。

随后，研究从组织学和分子水平进一步评估 Tec 对心肌重构，尤其是心肌肥厚和纤维化的影响。WGA 染色显示，与对照组相比，TAC 小鼠心肌细胞明显增大，而 Tec 处理可显著逆转这一变化。α-SMA 免疫荧光强度和 Masson 三色染色显示，Tec 可显著降低心脏组织纤维化程度和胶原沉积。Masson 染色还显示，Tec 可改善 TAC 诱导的肌原纤维排列紊乱，并减少病理性肌纤维间隙。

与上述病理学结果一致，Tec 处理后，纤维化相关标志物 α-SMA、Col1α 和 CTGF，以及心肌肥厚相关基因 ANP 和 BNP 的转录水平和蛋白表达均显著低于未治疗 TAC 小鼠。总体来看，Tec 可有效减轻 TAC 诱导的病理性心肌重构，包括心肌肥厚和纤维化。

图1 Tec 治疗改善 TAC 诱导小鼠模型中的心功能障碍并提高生存率。
A：Tec 化合物的化学结构；
B：实验设计：8 周龄雄性小鼠接受假手术或横主动脉缩窄术（TAC），随后给予 Tec（75 mg/kg，每两天一次，灌胃）或生理盐水治疗 4 周；
C：TAC 组与 TAC+Tec 组生存曲线比较，n=16；
D：代表性超声心动图图像，比较各组心脏结构；
E–H：心功能参数，包括左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室收缩末期内径（LVIDs）和舒张末期内径（LVIDd），n=5；
I–J：不同组心脏大体形态图像及心重/胫骨长度（HW/TL）比值，n=6；
K–L：不同组肺组织大体形态图像及肺重/胫骨长度（LW/TL）比值，n=6；
M：HE 染色心脏组织切片。
Veh：vehicle，*p<0.05，***p<0.001。

图2 Tec 治疗减轻 TAC 诱导的心肌肥厚、纤维化及病理基因表达。
A：各实验组心肌细胞形态的 WGA 染色；
B：WGA 染色图像中心肌细胞横截面积定量，n=120，n 表示细胞数量；
C：α-SMA 免疫荧光染色，显示平滑肌细胞分布；
D：α-SMA 荧光强度统计分析，n=5；
E：Masson 三色染色显示心肌纤维化；
F：E 图中纤维化面积百分比定量，n=5；
G–K：α-SMA、Col1a、CTGF、ANP 和 BNP 的 mRNA 表达水平，归一化至对照组，n=6；
L：Western blot 检测 ANP、BNP 和 β-tubulin 蛋白表达，其中 β-tubulin 作为内参。
Veh：vehicle，***p<0.001。

2. 体外药理学验证 Tec 抗心肌细胞肥大的治疗潜力

为研究 Tec 对心肌细胞增大的影响，研究开展了一系列体外实验。首先采用 CCK-8 法检测细胞活力，结果显示，新生大鼠心肌细胞（NRCMs）在 Tec 浓度不超过 20 μM 时仍保持良好活性；而当 Tec 浓度超过该阈值，即 40–80 μM 时，细胞毒性显著增加。进一步时间梯度分析显示，20 μM Tec 在 72 h 内不会影响细胞活力。

随后，为评估 Tec 对心肌肥厚的抑制作用，研究采用苯肾上腺素（PE）诱导 NRCMs 肥大，并联合 20 μM Tec 处理 36 h。结果显示，Tec 联合处理显著降低 PE 诱导的心肌肥厚标志物 ANP 和 BNP 上调，并且这种降低同时体现在 mRNA 和蛋白水平。α-actinin 免疫荧光染色及定量分析进一步显示，Tec 可有效缓解 PE 诱导的心肌细胞面积增大。

总体而言，这些结果表明，Tec 可通过抑制肥厚相关基因表达和减少细胞体积增大来减轻 PE 诱导的心肌细胞肥大，提示其具有治疗心肌肥厚的潜力。

图3 Tec 对 PE 诱导心肌细胞肥大的抑制作用。
A：新生大鼠心肌细胞经 0、5、20 和 80 μM Tec 处理 24 h 后，采用 CCK-8 法检测细胞活力，n=4；
B：心肌细胞经 Tec（20 μM）处理不同时间点（0–72 h）后的细胞活力，n=4；
C–G：NRCMs 经苯肾上腺素（PE，10 μM）和 Tec（20 μM）处理 36 h，以研究 Tec 对 PE 诱导心肌细胞肥大的影响；
C–D：心肌肥厚相关基因 ANP 和 BNP 的相对 mRNA 表达水平，n=5；
E：Western blot 检测 ANP 和 BNP 蛋白表达；
F：NRCMs 的 α-actinin 免疫荧光染色，绿色显示 α-actinin，用于定量细胞大小；细胞核以 DAPI 蓝色复染；
G：α-actinin 染色图像中心肌细胞横截面积定量，n=5。
Veh：vehicle，***p<0.001。

3. Tec 保护线粒体完整性并恢复氧化还原稳态，从而减轻心肌肥厚

心脏富含线粒体，并高度依赖线粒体进行能量代谢和维持正常功能。已有研究显示，线粒体功能障碍在病理性心肌肥厚中发挥重要作用。为探讨 Tec 对线粒体的调控作用，研究将 GeneCard 数据库中的心肌肥厚相关基因与 SwissTargetPrediction 预测的 Tec 靶蛋白取交集，获得 77 个潜在重叠靶点。GO 分析显示，这些靶点富集于氧化应激反应和脂质代谢相关通路，提示 Tec 可能影响维持线粒体健康和氧化还原平衡的关键过程。

透射电镜结果显示，Tec 可恢复 TAC 破坏的线粒体结构，表现为碎片化线粒体减少、线粒体密度增加，并逆转线粒体肿胀，即线粒体中位面积和形态不规则程度降低。进一步形态计量分析显示，Tec 显著恢复线粒体嵴完整性，增加每个线粒体中的嵴数量，并改善肌原纤维连续性，提示其可缓解病理性心脏重构。

同时，Tec 可减轻氧化应激，表现为 DHE 荧光和线粒体超氧阴离子 MitoSOX 水平均下降。机制上，Tec 增强了线粒体抗氧化能力，使 MnSOD 活性显著升高，同时总 SOD 活性、谷胱甘肽（GSH）水平和 GSH/GSSG 比值也升高，提示细胞整体抗氧化防御能力得到增强。

关键的是，Tec 可恢复线粒体呼吸功能，在压力负荷处理的心肌细胞中保护基础呼吸、ATP 生成能力和最大呼吸能力。线粒体复合物 I–V 活性检测进一步证实，Tec 可纠正 TAC 诱导的电子传递链功能障碍。心脏组织 ATP 含量升高也进一步支持 Tec 可改善生物能量代谢。综上，Tec 通过保护线粒体超微结构、恢复呼吸链功能并增强氧化还原稳态发挥心脏保护作用。

图4 Tec 通过改善线粒体功能和降低氧化应激，对心肌肥厚发挥保护作用。
A：Venn 图显示 GeneCard 数据库检索的心肌肥厚相关基因与 SwissTargetPrediction 预测的 Tec 靶蛋白之间的重叠；
B：77 个重叠基因相关生物过程（BP）的 GO 分析；
C：小鼠心脏组织透射电镜图像，显示线粒体形态。上图为低倍图，粉色区域标出解体线粒体；下图为上图所示区域的放大图；
D–F：每高倍视野（HPF）中解体线粒体数量、心脏组织线粒体密度，以及 TEM 图像中心脏组织线粒体面积的定量分析；
G：DHE 染色显示心脏组织氧化应激；
H：DHE 荧光强度定量，n=6；
I：MitoSOX 染色显示对照或 PE 条件下，经 vehicle 或 Tec 处理心肌细胞中的线粒体超氧阴离子水平；
J：MitoSOX 荧光强度定量，n=5；
K：小鼠心脏组织 MnSOD 酶活性定量，n=5；
L：心肌细胞氧耗率（OCR）代表性曲线。Oligo：寡霉素；Rot/AA：鱼藤酮/抗霉素 A；
M–O：心肌细胞基础呼吸、ATP 生成和最大呼吸定量，n=4。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

4. Tec 通过 PI3K-AKT 非依赖性蛋白酶体降解通路，稳定 MCL1 并抑制其泛素化依赖性降解

为探索 Tec 如何调控线粒体稳态，研究对 77 个重叠候选基因进行 KEGG 通路分析，发现其中 11 个基因与 PI3K 信号通路相关，提示 PI3K 通路可能参与 Tec 的心脏保护作用。考虑到 PI3K-AKT 通路在病理性心肌肥厚中的重要性，研究进一步分析 Tec 与该通路的关系。

研究构建蛋白-蛋白相互作用网络，并利用 Cytoscape 中的 CentiScape 识别出 22 个枢纽基因，其中 6 个也属于 PI3K 通路成分。分子对接模拟显示，MCL1 与 Tec 具有最高亲和力，即结合能最低。MCL1 是维持线粒体完整性和抗凋亡的重要调节因子。

功能实验显示，PE 刺激导致心肌细胞中 MCL1 转录水平降低，并增加 AKT 磷酸化，但 Tec 治疗并不影响这些变化。重要的是，Tec 可显著阻止 PE 诱导的 MCL1 蛋白耗竭，提示 Tec 是在转录后水平稳定 MCL1，并且这一机制不依赖 PI3K-AKT 通路。

进一步时间梯度实验显示，在 PE 应激下，MCL1 蛋白降解加速，而 Tec 治疗显著减缓该过程。蛋白酶体抑制剂 MG132 可恢复 PE 处理细胞中的 MCL1 水平，而溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）不能恢复，说明蛋白酶体降解是主要途径。Tec 对 MCL1 的保护作用与 MG132 类似，可有效抵消 PE 诱导的 MCL1 丢失。

此外，PE 处理可剂量依赖性增强 MCL1 泛素化，而 Tec 显著降低 MCL1 泛素化水平。综合来看，这些结果提示，Tec 可能通过抑制泛素化依赖性蛋白酶体降解来稳定 MCL1，从而缓解心肌肥厚，并且该效应独立于 PI3K-AKT 信号通路。

图5 Tec 通过泛素化降解途径有效调控 MCL1 稳定性。
A：77 个重叠基因的 KEGG 通路分析，突出显示 11 个与 PI3K 信号通路相关的基因；
B：重叠基因蛋白-蛋白相互作用网络，颜色越深表示基因连接度越高；
C：通过 Cytoscape 中的 CentiScape 识别 22 个枢纽基因，并与 PI3K 通路基因取交集得到 6 个重叠基因。Tec 与这些基因的分子对接分析显示 MCL1 结合能最低；
D：Tec 与 MCL1 的分子对接图；
E：不同处理条件下心肌细胞中 MCL1 mRNA 水平，n=5；
F–H：Western blot 分析 AKT 磷酸化和 MCL1 蛋白表达，n=3；
I–J：在对照或 PE 条件下，经环己酰亚胺（CHX，100 μg/mL）处理后心肌细胞中 MCL1 蛋白水平的时间依赖性变化，n=3；
K–L：在 PE 或 PE+Tec 条件下，经 CHX 处理后心肌细胞中 MCL1 蛋白水平的时间依赖性变化，n=3；
M：PE 刺激心肌细胞中，溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ，50 μM）和蛋白酶体抑制剂 MG132（10 μM）处理 24 h 对 MCL1 蛋白表达的影响及统计分析，n=3；
N：不同处理条件下心肌细胞中 MCL1 蛋白表达及统计分析，n=3；
O：不同 PE 浓度下 MCL1 蛋白泛素化水平；
P：不同处理条件下心肌细胞中 MCL1 泛素化状态。
Veh：vehicle，*p<0.05，***p<0.001，ns：无显著差异。

5. Tec 增强 USP9X-MCL1 分子相互作用，从而减轻泛素化依赖性蛋白酶体降解

为明确 Tec 如何影响 MCL1 的泛素化介导降解，研究关注 USP9X。USP9X 是一种去泛素化酶，已知可通过抑制 MCL1 的蛋白酶体降解来稳定 MCL1。研究推测，Tec 可能通过调节 USP9X 与 MCL1 的结合来影响 MCL1 泛素化。

共免疫沉淀实验确认，在心肌细胞中内源性 MCL1 与 USP9X 存在相互作用；在 293T 细胞中，采用 HA 标记 MCL1 和 Flag 标记 USP9X 也进一步验证了二者相互作用。免疫荧光显微镜显示，MCL1 和 USP9X 在心肌细胞胞质中共定位，进一步支持二者存在物理关联。

鉴于 USP9X 在稳定 MCL1 中的核心作用，以及二者共定位现象，研究进一步推测 Tec 可能直接与 USP9X 结合。分子对接分析预测 Tec 与 USP9X 存在直接相互作用。为实验验证 Tec 的结合伙伴，研究采用生物素化 Tec 探针，并预先与链霉亲和素磁珠孵育，再从心肌细胞裂解液中拉下与 Tec 相互作用的蛋白。Western blot 分析显示，Tec 可与 USP9X 和 MCL1 相互作用，提示 Tec 可能作为分子桥梁促进 USP9X-MCL1 相互作用。

进一步实验显示，PE 刺激或 Tec 处理均不影响 USP9X mRNA 水平；Western blot 也证实，在体外 PE 诱导和体内 TAC 诱导的肥厚模型中，Tec 干预后 USP9X 蛋白表达保持稳定。为增强研究在人源细胞模型中的转化价值，研究在 AC16 人心肌细胞中检测 Tec 作用。结果显示，Tec 可显著抵消 AngII 诱导的 MCL1 蛋白下调，而 USP9X 蛋白水平保持不变。

值得注意的是，PE 或 AngII 单独刺激会明显削弱心肌细胞中 USP9X-MCL1 相互作用；但在相同病理条件下，Tec 处理可强烈增强这一蛋白复合物形成。进一步研究显示，敲低 USP9X 会消除 Tec 稳定 MCL1 蛋白的能力。Co-IP 分析还显示，Tec 可降低 PE 诱导的 MCL1 泛素化，而 USP9X 沉默可逆转该作用。

综上，这些结果表明，Tec 通过增强 MCL1 与 USP9X 的相互作用，减少 MCL1 泛素化依赖性降解。

图6 Tec 通过调节 MCL1-USP9X 相互作用影响 MCL1 的泛素化降解。
A–B：共免疫沉淀分析显示心肌细胞中 MCL1 与 USP9X 的相互作用；
C–D：在 293T 细胞中验证 HA 标记 MCL1 与 Flag 标记 USP9X 之间的相互作用；
E：心肌细胞免疫荧光显微图像。DAPI 蓝色显示细胞核，USP9X 绿色，MCL1 红色，合并图显示二者共定位；
F：Tec 与 USP9X 的分子对接图；
G：体外实验示意图，用于检测与 Tec 相互作用的蛋白。生物素化 Tec 探针预先与链霉亲和素磁珠孵育，再与心肌细胞裂解液孵育，随后洗脱结合复合物用于检测；
H：Western blot 检测 USP9X、MCL1 与 Tec 探针的相互作用；
I：不同处理组心肌细胞中 USP9X mRNA 表达水平，n=5；
J–L：Western blot 分析体内和体外肥厚模型中 Tec 处理后 USP9X 表达，并对 USP9X 蛋白水平进行 β-tubulin 归一化定量，n=4；
M：Western blot 分析 AC16 人心肌细胞经 Tec（20 μM）和/或 AngII（1 μM）处理后的 USP9X 和 MCL1 蛋白；
N–O：对 M 图中 MCL1 和 USP9X 相对蛋白表达进行定量，n=3；
P–Q：在 MG132 介导的蛋白酶体抑制条件下，心肌细胞经 10 μM PE 或 1 μM AngII 处理 36 h，并有或无 Tec（20 μM）干预，采用 Co-IP 分析 MCL1 与 USP9X 相互作用；
R–S：USP9X 敲低心肌细胞经 10 μM PE 和/或 Tec 处理 36 h 后，Western blot 分析 MCL1 蛋白水平，n=3；
T：Co-IP 分析心肌细胞中 MCL1 的泛素化水平。
***p<0.001，ns：无显著差异。

6. Tec 通过 MCL1 介导的抗心肌肥厚和抗氧化应激作用发挥心脏保护效应

为研究 Tec 是否通过 MCL1 依赖性机制对肥厚性心肌病发挥保护作用，研究在 MCL1 沉默的 NRCMs 中进行 PE 应激实验。结果显示，Tec 可显著降低 PE 诱导的心肌肥厚标志物升高，但 MCL1 沉默会抵消 Tec 的治疗效应。

免疫荧光定量进一步显示，Tec 可有效缓解 PE 诱导的细胞增大，而 MCL1 缺失会逆转这一作用。线粒体氧化还原分析显示，Tec 可成功降低 PE 诱导的心肌细胞 ROS 过度生成，表现为 MitoSOX 荧光强度下降；但在 MCL1 敲低后，这一保护作用消失。

此外，MCL1 敲低还显著消除了 Tec 增强细胞抗氧化能力的作用，包括提高 SOD 活性、增加 GSH 水平以及恢复 GSH/GSSG 比值。为直接评估线粒体能量代谢的功能后果，研究检测了细胞氧耗率（OCR）。结果显示，在 PE 挑战下，Tec 可大体维持线粒体呼吸功能，包括基础呼吸、ATP 生成和最大呼吸；然而，MCL1 沉默完全消除了 Tec 维持线粒体生物能量代谢的能力。

综上，这些结果强调，MCL1 在 Tec 抵抗心肌肥厚、氧化应激以及线粒体功能障碍中具有必不可少的作用。

图7 Tec 通过调控 MCL1 保护心肌细胞免受肥厚刺激诱导的线粒体功能障碍和心肌细胞肥大。
新生大鼠心肌细胞在存在或不存在 MCL1 敲低和 Tec 处理的条件下接受 PE 处理 48 h。
A–B：不同处理条件下 ANP 和 BNP mRNA 水平，n=5；
C：Western blot 显示 ANP、BNP 和 MCL1 蛋白水平；
D–E：α-actinin 标记心肌细胞的免疫荧光图像及心肌细胞横截面积定量，n=5；
F–G：采用 MitoSOX 染色显示心肌细胞线粒体 ROS 水平，并进行荧光强度定量，n=5；
H–J：不同实验条件下检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）水平，以及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG），n=5；
K：心肌细胞 OCR 代表性曲线。Oligo：寡霉素；Rot/AA：鱼藤酮/抗霉素 A；
L–N：心肌细胞基础呼吸、ATP 生成和最大呼吸定量，n=4。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

7. Tec 通过 USP9X 介导的 MCL1 稳定发挥抗心肌肥厚作用

基于 Tec 通过增强 USP9X 介导的去泛素化抑制 MCL1 泛素化、从而稳定 MCL1 的发现，研究进一步探讨 USP9X 是否对 Tec 抵抗 PE 诱导心肌细胞肥厚至关重要。

在 PE 应激心肌细胞中，USP9X 敲低显著消除了 Tec 对心肌肥厚标志物 ANP/BNP 的抑制作用，也消除了其逆转细胞增大的能力。此外，PE 诱导的线粒体 ROS 积累可被 Tec 缓解，但 USP9X 缺失会恢复氧化应激水平，说明 USP9X 对线粒体保护具有核心作用。

USP9X 缺失还会消除 Tec 对 PE 诱导氧化还原稳态失衡的保护作用，表现为其不能恢复 SOD 活性、不能升高还原型 GSH 水平，也不能正常化 GSH/GSSG 比值。

总体而言，Tec 通过 USP9X 依赖性稳定 MCL1 来抵抗 PE 驱动的病理性重构，并协调发挥抗心肌肥厚和线粒体保护作用。

8. Tec 通过 MCL1 依赖性机制，对 TAC 诱导的病理性重构发挥多维度心脏保护作用

为明确 MCL1 在 Tec 体内心脏保护作用中的作用，研究通过尾静脉注射 AAV9-cTnT 携带 MCL1 shRNA 或 scramble 对照，建立心肌细胞特异性 MCL1 敲低小鼠模型。RT-PCR 和 Western blot 结果确认 MCL1 抑制效率，证明模型构建成功。

随后，TAC 手术小鼠每 48 h 腹腔注射 Tec 75 mg/kg，持续 4 周。Kaplan-Meier 分析显示，与单纯 TAC 组相比，Tec 显著提高小鼠生存率，但这一获益在 MCL1 敲低组中消失。超声心动图显示，Tec 可通过提高 LVEF 和 LVFS、降低 LVIDs 来保护心功能，但这些效应在 MCL1 敲低小鼠中明显减弱。

形态学和组织学评估进一步显示，Tec 可减轻 TAC 诱导的 HW/TL 比值升高和心肌细胞横截面积增加，而 MCL1 敲低可逆转这些作用。此外，Tec 可在 mRNA 和蛋白水平下调心肌肥厚标志物 ANP/BNP，而 MCL1 抑制同样会抵消该效应。综上，Tec 主要通过 MCL1 依赖性通路缓解 TAC 诱导的心功能障碍和心肌肥厚。

在确定 MCL1 对 Tec 维持心功能至关重要之后，研究进一步考察其在心肌肥厚两个关键病理特征——纤维化重构和线粒体失调——中的作用。免疫荧光分析显示，Tec 可抑制 α-SMA 表达，而 MCL1 敲低会逆转这一作用。Masson 三色染色显示，Tec 可减少纤维化面积，并改善 TAC 诱导的肌原纤维排列紊乱、肌纤维间隙增大和组织完整性受损；但这些保护作用均被 MCL1 沉默抵消。

DHE 荧光定量显示，Tec 可有效降低氧化应激，但 MCL1 缺失后这一保护作用消失；MnSOD 酶活性变化也支持这一结果。透射电镜分析进一步显示，MCL1 敲低消除了 Tec 对线粒体完整性的保护作用，包括抵消其增加线粒体密度、减少碎片化和缓解线粒体肿胀的效果。更关键的是，MCL1 缺失还阻断 Tec 对线粒体嵴超微结构的恢复作用，使嵴严重程度评分和嵴密度改善均消失。

在结构改善的基础上，研究进一步发现，Tec 恢复线粒体复合物 I–V 活性的作用完全依赖 MCL1，因为 MCL1 沉默可完全消除这一保护作用。这建立了一个直接因果链条：MCL1 同时介导线粒体结构完整性恢复和生物能量功能恢复。此外，Tec 对肌原纤维连续性的修复同样依赖 MCL1，提示其可整体减轻病理性心脏重构。

这些数据共同证明，MCL1 是 Tec 在心肌肥厚中发挥抗纤维化和线粒体保护作用的核心调节因子，能够协调从结构损伤恢复到氧化磷酸化功能改善的全过程。

图8 Tec 通过调控 MCL1 减轻 TAC 诱导的心功能障碍和心肌肥厚。
心肌细胞特异性 MCL1 沉默小鼠及其野生型同窝对照小鼠接受 TAC 手术，以建立压力负荷诱导的心肌肥厚模型。实验组每隔一天灌胃给予 Tec（75 mg/kg），连续 4 周，随后进行超声心动图功能评估和心肌组织形态学分析。
A：通过 RT-PCR 和 Western blot 确认 MCL1 敲低效率，n=5；
B：不同处理组小鼠 Kaplan-Meier 生存曲线，n=15；
C：小鼠心脏代表性超声心动图图像；
D–G：超声心动图评估左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率、左心室舒张末期内径（LVIDd）和左心室收缩末期内径（LVIDs），n=5；
H：心脏形态代表性图像；
I：心重/胫骨长度（HW/TL）比值，n=5；
J：心脏组织 HE 染色代表图像；
K–L：WGA 荧光染色显示心肌细胞横截面积代表图像和定量分析，n=120，n 表示细胞数量；
M–N：小鼠心脏中 ANP 和 BNP 的相对 mRNA 表达水平，n=5；
O：Western blot 分析 ANP、BNP、MCL1 和 USP9X 蛋白水平。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：无显著差异。

图9 Tec 减少心肌肥厚中的纤维化并改善线粒体功能。
A–B：小鼠心脏中 α-SMA 免疫荧光染色及平均荧光强度定量，n=5；
C–D：Masson 三色染色显示心脏纤维化，并定量心脏组织纤维化面积，n=5；
E–F：DHE 荧光染色检测氧化应激，并定量心脏组织荧光强度，n=5；
G–I：心脏组织透射电镜代表图像、线粒体密度定量、解体线粒体定量；
J：心脏组织线粒体面积定量；
K：线粒体嵴严重程度评分；
L：每个线粒体的嵴数量。
**p<0.01，***p<0.001。

【Citation】:Chen X, Zhou G, Yuan T, et al. Tectorigenin attenuates cardiac hypertrophy via USP9X/MCL1-mediated mitochondrial stabilization[J].Redox Biology,2025: 103855.

【贡献】★★★★★

本研究证明，Tec 是一种具有多重心脏保护作用的天然化合物，可通过 USP9X 介导的 MCL1 去泛素化稳定线粒体功能，并抑制病理性心肌重构。

与传统依赖 PI3K-AKT 信号通路的保护机制不同，Tec 可绕开 PI3K-AKT 通路，通过增强 USP9X-MCL1 相互作用，减少 MCL1 泛素化和蛋白酶体降解，从而维持 MCL1 蛋白稳定。MCL1 的稳定进一步保护线粒体结构完整性，恢复线粒体呼吸链功能，增强 ATP 生成，并降低氧化应激，最终减轻心肌肥厚、纤维化和心功能障碍。

图10 所示机制总结为：肥厚刺激会破坏 MCL1-USP9X 相互作用，触发 MCL1 泛素化介导的降解，进而导致线粒体功能障碍和病理性心肌细胞肥大，最终推动心力衰竭发生；而 Tec 可通过稳定 MCL1-USP9X 复合物、降低 MCL1 泛素化并保护线粒体完整性，从而减轻肥厚性损伤。

整体来看，本研究揭示了 “USP9X-MCL1-线粒体稳态” 是 Tec 抵抗病理性心肌肥厚的关键机制，为开发靶向 USP9X-MCL1 轴的心肌肥厚和心力衰竭治疗策略提供了新的实验依据。