Chem | 许红涛/马培翔/侯卫团队利用短夹板 RNA 介导的单链DNA编码实现无标记活细胞DEL库筛选|dna|rna|介导|序列|细胞|膜蛋白|许红涛|马培翔

DNA 编码化合物库（DEL）已成为现代小分子药物苗头化合物发现的重要技术平台。类比生物学中心法则，DEL通过“化学中心法则（Chemical Central Dogma，Acta Pharm. Sin. B 2024, 14, 492）”，将基因型（DNA编码序列）与表型（与DNA共价偶联的小分子）共价偶联，实现“小分子— DNA编码—筛选—解码”的闭环信息传递。其中单链 DNA 编码库（ssDEL）在复杂靶点适配与活细胞筛选中具备独特优势，但传统 ssDEL的构建方法存在序列冗余、纯化繁琐、连接特异性不足等瓶颈，难以满足高效建库与精准筛选的需求。

近日，上海科技大许红涛/上海交通大学医学院附属第九人民医院马培翔/浙江工业大学侯卫团队针对这一挑战，基于SplintR 连接酶开发了短夹板 RNA 介导的ssDNA 连接体系，建立了高效、特异性的ssDEL构建平台，实现无标记活细胞水平的超高通量ssDEL筛选，为膜蛋白等难靶药物发现提供底层技术支撑。该研究成果以Splint RNA-mediated single-stranded DNA-encoded library construction and label-free live-cell selection为题发表在Chem期刊上。

本研究首先系统优化SplintR介导的ssDNA连接条件，阐明连接效率与序列组成的规律。研究证实，SplintR 连接酶可在12–14 nt的短夹板 RNA 驱动下实现高效 ssDNA 连接；该体系对连接位点的单碱基错配具有严格识别能力，从源头降低编码错误。由此团队绘制编码效率图谱（CEM），明确受体序列与供体序列的优势碱基组合，实现夹板 RNA 的精准设计与高效连接。连接后夹板 RNA 可经 RNase H 快速去除，无需复杂纯化，显著提升 ssDEL 纯度与合成便捷性。

基于优化的连接体系，团队成功构建 ssDEL 合成与筛选技术体系。采用 “split-and-pool” 策略，完成10⁴量级的验证库与2.95×10⁶量级的多样性库的高效合成，PAGE 与 NGS 验证文库均一性与完整性。对比筛选显示，ssDEL 较传统双链 DEL（dsDEL）空间位阻更小，靶点富集效率提升约 2.7 倍；短序列 ssDNA（60 nt）较长序列 ssDNA（110 nt）富集效率提升约 8 倍。该体系兼容 DNA 兼容化学反应，可实现多模块砌块拼接，为大规模 ssDEL 标准化制备提供可行方案。

团队进一步开发SplintR 介导邻近连接 PCR 方法（SIMPL），实现无标记活细胞水平的精准筛选。该方法无需蛋白固定、荧光标记或细胞改造，依靠配体与识别探针结合带来的核酸邻近效应触发连接，实现高灵敏度检测。针对活细胞表面肿瘤相关靶点 CAXII，从 295 万库容的 ssDEL 中直接筛选获得 4个高亲和力配体，其中最优化合物的解离常数达到亚纳摩级别。该技术突破活细胞筛选瓶颈，适用于可溶性蛋白与膜蛋白靶点，为新药发现提供更接近生理环境的筛选范式。

项目团队长期聚焦于DEL技术的基础与应用研究，发展了一系列DNA兼容的化学反应，包括Se-N交换点击化学（SeNEx，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202318534）等；并率先在国际上系统开展DNA编码天然产物库（nDEL, Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 9254）及含硒DNA编码化合物库（SeDEL，Angew. Chem. Int. ed. 2020, 59, 13273; 2022, 61, e202206516; 2025, 64, e202500942; Chem, 2023, 9, 3335）的构建与筛选研究，显著拓展了DEL库的化学空间。未来，随着体系进一步优化，该平台有望拓展至更多疾病相关膜蛋白、GPCR、离子通道等难靶靶点的配体发现，并可与共价筛选、构象选择性筛选、体内原位筛选等方向结合，推动新药发现从体外蛋白水平走向细胞与活体水平，加速先导化合物发现与临床转化进程。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451929426000112

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