40多年前胚胎干细胞（ESC）的发现，推动再生医学快速发展，其体外无限增殖与多向分化能力为细胞治疗奠定基础。2006年诱导多能干细胞（iPSC）的诞生，进一步丰富细胞治疗工具库，可从非胚胎来源获取目标细胞，降低伦理争议。
全球人多能干细胞（hPSC）相关临床试验数量快速增长，截至2024年底已达115项。其中，人iPSC（hiPSC）为基础的试验占比显著提升，目前约占所有干细胞研究的60%。
尽管研究热度高，尚无hPSC衍生产品获批商业化应用，而成人干细胞衍生或含成人干细胞的产品已有40多种上市。hPSC技术较新，临床应用前需克服的安全壁垒远高于其他细胞治疗产品。
hPSC衍生细胞治疗产品（CTP）的安全担忧主要集中于两大特性，这是其临床转化的关键障碍：1）残留未分化hPSC致畸胎瘤风险。最终产品中若残留未分化hPSC，其在体内具有极强的畸胎瘤形成能力，可能导致严重不良事件。目前仅报道1例—2型糖尿病患者接受hiPSC衍生β细胞治疗后2个月，出现hiPSC来源畸胎瘤并伴随局部淋巴结转移，凸显该风险的现实性。可以通过体内外实验，全面评估hPSC衍生神经干细胞、多巴胺能神经元、心肌细胞及CAR-NK/ILC细胞的畸胎瘤形成风险，常用免疫缺陷啮齿类动物检测体内形成潜力，用流式细胞术、qPCR等检测产品中残留未分化细胞；2）基因组不稳定性与成瘤性。未分化hPSC在体外培养或分化过程中，可能出现基因组突变、拷贝数变异等不稳定性，进而增加细胞的成瘤潜力，这也是监管机构关注的核心风险之一。
2015-2024年的7份hESC/hiPSC衍生产品科学建议报告显示，早期多通过“专项体内成瘤性研究”或“含成瘤性终点的一般毒性研究”评估畸胎瘤风险。近期趋势发生转变，企业逐渐依赖现有文献、体外数据等，来证明无需开展体内研究，减少动物实验依赖。不过，无论如何，为确保临床安全，hPSC衍生细胞需达到预期分化阶段；生产过程中必须采用严格方法证明“残留未分化hPSC已清除”，方可提交监管审批。
2015年底，健康与环境科学研究所（HESI）成立“细胞治疗-追踪、循环与安全（CT-TRACS）委员会”，成员涵盖澳、欧、日、英、美40多个公私机构，共同解决细胞治疗的安全与开发难题。该委员会发文全面概述了hPSC衍生CTP成瘤性的潜在风险，重点聚焦“残留未分化hPSC”这一核心风险点，并总结了当前可用于缓解这些风险的体外检测方法，通过对比体外实验与体内方法的灵敏度，为hPSC衍生CTP成瘤性风险的最优评估策略提供指导。
hPSC衍生CTP的成瘤风险概述
在讨论残留未分化hPSC之前，有必要先审视人多能干细胞衍生细胞治疗产品（hPSC-derived CTPs）整体的潜在成瘤风险。下表总结了2019年HESICT-TRACS委员会立场文件中基于专家意见提出的潜在风险及相应缓解策略。
在人多能干细胞系建立或产品制造过程中，基因组异常积累后可能出现非预期细胞转化，这是该类细胞治疗产品成瘤性的额外潜在风险。背景体细胞突变受供体细胞类型和年龄影响，而重编程过程中对已存在癌症驱动突变的潜在筛选，可能进一步增加成瘤风险。
目前有多种体外检测方法可评估基因组完整性或细胞转化情况，可通过下一代测序（NGS）及近年出现的纠错型NGS，对基因组单核苷酸变异和拷贝数变异进行检测，以发现基因组改变。核型分析、荧光原位杂交或比较基因组杂交可用于检测大片段染色体异常。对于基因修饰产品（如CAR-T细胞），可通过插入位点分析评估插入性突变的潜在风险。可对恶性转化细胞的特征（如永生化、转录变化、生长促进、锚定依赖性（贴壁细胞）、生长因子非依赖性（T细胞产品））进行评估，以识别非预期转化细胞。
当然，该领域在检测方法标准化方面面临重大挑战与机遇，因为并非所有检测方法都有全球统一的标准方案。
hPSC残留评估
残留hPSC的分类界定
在hPSC衍生CTPs中，“杂质（impurities）”“污染物（contaminants）”“残留细胞（residual cells）”常被互换用于描述残留未分化hPSC，但从监管角度，三者控制严格程度不同。
ICH Q6B法规依据：该法规虽未涵盖CTPs，但对“杂质”和“污染物”有明确定义。杂质分为“工艺相关杂质”（如细胞底物、培养过程产物）和“产品相关杂质”（如制造/储存中产生的分子变体、前体及降解产物）；污染物指非预期引入的制造无关物质。据此，残留未分化hPSC更符合“产品相关杂质”定义。
其他地区法规参考：欧盟先进治疗医药产品法规中，若药物活性成分定义为分化细胞群，祖细胞类型被归为产品相关杂质；加拿大CTP指南将具有不良生长潜力的细胞列为杂质。综合来看，残留未分化hPSC应被归类为“杂质”而非“污染物”。
因残留未分化hPSC有极高畸胎瘤形成潜力，最终产品中其可耐受量需严格限制，并通过设定尽可能灵敏的可接受标准证明合理性。
残留hPSC的体内检测方法
1.体内检测的法规要求
hPSC衍生CTPs因存在畸胎瘤形成和基因组异常风险，成瘤性高于人体体细胞或成体干细胞衍生产品。进入临床试验前，通常需开展非临床体内成瘤性研究，观察周期需覆盖实验动物寿命（如免疫缺陷啮齿类约9-12个月），或直至CTPs从动物体内清除。
2.核心检测方法：畸胎瘤形成试验
该试验是评估hPSC多能性的“金标准”，通过向免疫缺陷动物注射特定数量hPSC，监测数周至数月内畸胎瘤形成情况，但其存在成本高、耗时长、需专业技术的局限。以下为试验设计关键影响因素：
动物模型：常用模型包括T细胞缺陷裸鼠、T/B细胞双缺陷SCID鼠、T/B细胞缺陷且NK细胞/巨噬细胞活性降低的NOD/SCID鼠，以及T/B/NK细胞均缺陷且巨噬细胞/树突状细胞功能异常的NOG/NSG鼠。其中NOG/NSG鼠移植成功率最高，且有研究显示，其与具有功能性人类免疫细胞的Hu-CD34 NSG鼠相比，畸胎瘤生长速率和病理特征无差异。
细胞解离方式：单细胞解离是实现hPSC定量移植的关键，但单细胞易凋亡，需更高数量才能形成畸胎瘤。可通过共注射细胞外基质（如Matrigel）或丝裂霉素灭活的饲养细胞，提升解离后hPSC的植入效率。
注射部位：不同部位畸胎瘤形成率差异显著。肾包膜注射形成率最高（100%），其次为含Matrigel的皮下注射（94%）、睾丸内注射（60%）、无Matrigel的皮下注射（33%）、肌肉内注射（12.5%）。皮下注射因操作简便、便于观察，是最常用部位。
3.体内检测的敏感性评估
试验设计（动物模型、细胞解离、注射部位等）和细胞来源均会影响畸胎瘤形成，而畸胎瘤形成所需hPSC的最小数量，是评估体内检测敏感性的核心指标。
皮下注射：向免疫缺陷裸鼠注射1×106hESC可诱导畸胎瘤；若hPSC与Matrigel、饲养细胞共注射，1×102hESC即可在NOD/SCID鼠中形成畸胎瘤；NOG鼠中，hiPSC形成畸胎瘤的50%肿瘤产生剂量（TPD50）为102.12个细胞；加入ROCK抑制剂（Y-27632，抑制hPSC解离凋亡）可进一步提高畸胎瘤形成率。
其他部位：肾包膜、肌肉、睾丸等部位注射所需hPSC最小数量高于皮下注射。
临床等效部位考量：监管要求体内试验需采用与临床接近的给药途径，但目前多数hPSC衍生CTPs的临床研究集中于恶性肿瘤、心血管疾病、眼部退行性疾病、神经退行性疾病，其临床移植部位（如静脉、心肌内、视网膜下）对应的畸胎瘤形成所需hPSC数量（如>1×10⁴），高于皮下注射“金标准”所需数量，且神经组织移植的hPSC最小畸胎瘤形成数量暂无明确报道。
4.体内成瘤性检测的局限性
最优条件下（向NOG/NSG鼠皮下注射，联用细胞外基质、饲养细胞、ROCK抑制剂），体内检测可发现低至1×10²个残留hPSC，但受啮齿类动物最大可行剂量（MFD，1-5×10⁷个细胞）限制，其敏感性仅为0.0002%-0.001%，与现有体外检测敏感性相当或更低。
若临床移植部位为眼部或中枢神经系统，动物试验的MFD会显著降低（如视网膜下移植仅1.5×10⁴个细胞，脊髓/纹状体注射仅2-5×10⁵个细胞），直接导致检测敏感性下降。
为符合监管申报要求，体内试验需使用与临床一致的细胞制剂，无法联用Matrigel、饲养细胞、ROCK抑制剂，进一步降低了畸胎瘤形成的可检测性。
残留hPSC的体外检测方法
体外检测的核心背景与原则
伦理与法规驱动：减少动物痛苦是伦理研究的核心，且体内畸胎瘤检测敏感性不足，因此体外检测成为重要替代方案。
监管认可度提升：美国FDA等机构逐渐认可体外检测数据，认为其可在特定条件下替代体内检测，预测成瘤风险。
检测技术分类：体外检测主要基于三类原理，分别是检测hPSC特异性RNA、检测hPSC特异性表面标志物、检测细胞培养液中hPSC特异性成分，以及通过高效培养体系直接检测未分化hPSC（不同文献来源的hPSC体外检测数据汇总如下表所示，推荐将这些高敏感性检测纳入CTP安全性评估）。
各类体外检测方法详情
1.hPSC特异性RNA检测
通过PCR技术检测未分化hPSC特有的基因转录本，核心是选择合适的标志物并搭配高灵敏的扩增方法。
标志物选择：
常用核心标志物为LIN28A，被建议作为CTP安全性评估的hPSC特异性标志物。
为应对基因表达异质性，需搭配其他标志物，如针对hiPSC衍生心肌细胞的ESRG、LINC00678等，针对皮肤成纤维细胞、神经干细胞等的特异性基因，以及lncRNA、miRNA。
检测方法与敏感性：
qPCR：检测限（LOD）最低可达0.001%，但对高循环阈值（Ct>29）的mRNA定量能力较弱。
dPCR：LOD最低可达0.0001%，无需标准曲线，可直接输出绝对值，对微量mRNA定量更稳健、灵敏。
RT-LAMP：可处理更多样本量（最多100μgDNA或5μgRNA），抗干扰能力强，使用多标志物时LOD可达0.00002%。
局限性：仅能检测表达目标标志物的细胞，可能遗漏低表达或不表达标志物的残留hPSC；且只能提供群体平均数据，无单细胞分辨率。
2.hPSC特异性表面标志物检测
通过抗体或特殊标记识别未分化hPSC表面的蛋白质或糖结构，核心是平衡检测速度与敏感性。
流式细胞术：需新鲜单细胞样本，结果依赖门控策略，LOD约为0.1%，敏感性较低，多用于研究而非质量控制。
表面增强拉曼散射（SERS）：用标记金纳米颗粒结合SSEA-5/TRA-1-60抗体，LOD可达0.0001%，是表面标志物检测中最灵敏的方法，但仍需单细胞悬液。
糖脂糖链检测：通过糖印迹法检测hPSC特异性糖脂糖链（如Gb3、SSEA-4），仅需1000个细胞，但LOD约为0.25%，敏感性低于其他体外方法。
3.细胞培养液中hPSC特异性成分检测
属于非侵入性检测，无需破坏CTP样本，适合珍贵移植材料的检测。
糖蛋白检测（GlycoStem试验）：检测hPSC分泌的足糖萼蛋白，优化后的GlycoStem-HP试验，在hiPSC衍生神经干细胞背景下LOD为0.05%。
培养液中miRNA检测：检测hPSC释放到培养液中的特异性miRNA（如miR-302家族），qPCR法在视网膜色素上皮细胞背景下LOD可达0.001%，但部分检测仅为定性，不适合质量控制。
4.未分化hPSC高效培养体系（HEC试验）
直接检测具有增殖能力的未分化hPSC，不依赖标志物，是独特的功能型检测方法。
核心原理：在特定条件（层粘连蛋白-521包被板、Essential8培养基）下培养CTP一周，扩增未分化hPSC后计数克隆数。
敏感性与优化：
基础HEC试验：在间充质基质细胞背景下LOD为0.001%，经多中心验证（如MEASURE项目）稳定性良好。
联合磁珠分选（MACS）：用抗TRA-1-60磁珠富集hPSC后，在T细胞背景下LOD可达0.00002%。
改良培养条件：在hiPSC衍生心肌细胞背景下，无需富集即可达到0.0005%的LOD。
优势与局限性：可直接检测增殖性未分化hPSC，敏感性与PCR法相当；但耗时较长，是各类体外检测中操作周期相对久的方法。
检测方法的国际标准化推进
HESICT-TRACS委员会联合日本MEASURE项目，开展多中心研究，评估并优化体外检测方法。目前已将dPCR和HEC试验作为核心候选，推动其成为残留hPSC体外成瘤性检测的国际标准方法，解决当前缺乏统一检测标准的问题。
dPCR检测与HEC检测的多中心研究详情
dPCR作为高敏感性残留hPSC检测方法，研究通过“两步两臂”设计，解决多实验室间的检测差异性问题，具体如下：
1.研究设计与流程
Step1（仅dPCR检测差异性评估）：
由单个实验室制备“掺杂样本”（含特定浓度未分化hiPSC的RNA样本），并分发给各参与实验室。各实验室仅开展dPCR分析，检测CNMD、ESRG等7个标志物基因，评估单一环节的检测变异性。
Step2（全流程差异性评估，分两臂）：
Arm1：向各实验室分发hiPSC和hiPSC衍生心肌细胞（iCM），由实验室自行完成“细胞掺杂→RNA提取→dPCR检测”全流程，仅评估3个选定标志物基因，不使用内参基因。
Arm2：各实验室解冻冷冻保存的hiPSC和iCM，自行完成全流程，检测9-10个标志物基因及1个内参基因，目前结果已完成待单独发表。
2.关键研究结果（Step1与Step2 Arm1）
标志物基因筛选：通过回归分析、精密度、检测限（LOD）等参数评分，从7个基因中筛选出ESRG、LINC00678、LIN28A3个最优标志物。
检测敏感性：成功检测到浓度低至0.0003%的未分化hiPSC。
变异性来源定位：Step2 Arm1的实验室内部重复性和实验室间再现性，均高于Step1。实验室间差异的核心来源是hiPSC掺杂步骤，而非dPCR检测本身。建议在确定CTP中hPSC杂质的LOD时，需重点考虑细胞掺杂的实验室间差异，尤其是实验室内部引入dPCR检测时。
HEC检测的多中心研究
HEC检测通过培养扩增未分化hPSC并计数集落，研究在4个独立实验室开展，验证其敏感性与再现性。
1.研究设计与流程
样本制备：将hiPSC以0.0005%或0.0015%的浓度，掺杂到iCM中。
培养与检测：在特定条件下培养7天后，通过碱性磷酸酶（ALP，hPSC特征标志物）染色，显微镜下计数hiPSC集落数量。
评估指标：验证不同实验室间的检测敏感性、阳性检出率（TPR）及结果重复性。
2.关键研究结果
检测敏感性：所有实验室均成功检出低至“1×10⁶个iCM中掺杂5个hiPSC”的样本，即LOD达到0.0005%。
特异性：未掺杂hiPSC的样本中，无实验室检出ALP阳性集落，特异性良好。
阳性检出率（TPR）：检测0.0005%浓度hiPSC时，平均TPR为92%，且所有实验室两次重复实验的TPR均接近100%。
结果稳定性：
实验室内部重复性变异系数为24%-36%，实验室间再现性变异系数为36%-44%，证明方法稳健性高。
再现性差异主要源于实验室内部重复性，核心影响因素仍是hiPSC掺杂步骤。
优化策略：使用“色原酮1、依米立酮、多胺、反式ISRIB”的小分子混合物（替代ROCK抑制剂），可提升hiPSC存活率，进一步提高检测敏感性。
两种方法的核心结论
方法互补性：dPCR（基于RNA标志物）与HEC（基于细胞增殖能力）为正交方法，前者检测基因表达，后者直接检测功能活性细胞，可从不同维度评估残留hPSC风险。
应用建议：两种方法均具有高敏感性和多中心验证的稳健性，研究发起者可根据自身CTP类型及样本特性，选择最适合的质量控制方法。
体内畸胎瘤检测的敏感性差异
体内畸胎瘤检测用于检测残留未分化hPSCs的敏感性，会因检测方案、动物模型和移植方法不同而存在差异。文献表明，当细胞与细胞外基质、饲养细胞和ROCK抑制剂共同皮下移植到重度免疫缺陷啮齿动物（如NSG小鼠、NOG小鼠）体内时，检测敏感性最高，预估在0.0002%–0.001%之间。但如果为模拟临床制剂而不联合移植，则敏感性会显著降低。
这一结果说明，现有体外检测的敏感性高于体内检测，尤其是在采用符合监管申报要求的方法（如模拟预期临床制剂和移植部位）时。HESICT-TRACS已启动国际多中心研究，评估高敏感性体外检测（包括基于dPCR的检测和HEC检测）的可行性。该研究以诱导心肌细胞（iCMs）为背景细胞，结果显示两种检测均具有稳健性和足够敏感性，可作为体内检测的替代方案（检测限分别为0.0003%–0.001%和0.0005%）。
监管要求与体外检测的替代建议
美国、欧盟和日本的监管指南（如下表所示）通常要求通过体内成瘤性研究，评估人多能干细胞衍生细胞治疗产品（CTPs）形成畸胎瘤的潜在风险，但也鼓励将体外和/或离体方法作为体内研究的补充。
然而，基于上述原因，HESICT-TRACS建议：若能建立经验证且敏感性更高的体外检测（如基于dPCR的检测和HEC检测），可采用体外检测替代体内检测。
体外检测的敏感性验证与注意事项
需通过加标实验评估每种产品体外检测的敏感性效率，且检测限需确认与体内检测报告值相当或更低。
HESICT-TRACS的多中心研究表明，人多能干细胞悬液的准确制备和样本加标，是评估检测敏感性和精密度的关键。人多能干细胞加标步骤是导致实验室间差异的主要原因，因此需在产品检测所在机构确定检测限。
加标到人多能干细胞产品中的细胞系差异可能影响检测结果（尤其在HEC检测中），因此需使用每种产品的起始材料人多能干细胞系进行检测验证（尤其是确定检测限时）。若使用多种不同人多能干细胞系作为起始材料，验证过程中需考虑潜在的批次间差异。
体外检测的选择与标志物考量
每种体外检测（包括基于dPCR的检测和HEC检测）均有其优势、劣势和局限性，因此需针对每种细胞治疗产品，谨慎评估检测方法的选择。
通过检测人多能干细胞特异性标志物来识别未分化细胞时，LIN28A是敏感性较高的标志物，已用于心肌细胞、多巴胺祖细胞、CAR-NK/ILC细胞和视网膜色素上皮细胞产品的临床试验准入质量检测。
但有研究指出，LIN28A不适用于某些细胞类型（如肝细胞），因为它不仅在未分化细胞中表达，也会在相应的分化细胞中表达。
标志物的通用性与局限性方面。已有研究基于RNA-seq数据提出了识别潜在标志物的策略，也有少数研究探索了通用人多能干细胞特异性标志物，但这些研究仅在少数代表性分化细胞中验证了标志物，尚未证明其对所有细胞治疗产品的适用性。部分标志物在分化过程中会下调，这意味着即使是同一细胞谱系的产品，若细胞处于低分化状态，为特定细胞谱系验证的标志物也可能无法有效发挥作用。由于标志物的特异性和线性依赖于背景细胞，其检测限也会随之变化，因此需为每种细胞治疗产品选择合适的标志物并进行验证。
HEC检测的特点与局限性方面。HEC检测不依赖人多能干细胞内/表面表达的特异性RNA或表面蛋白标志物，可直接检测未分化人多能干细胞。尽管该检测需要1周的培养时间，但有研究表明它适用于悬浮细胞和贴壁细胞等多种类型，因此可广泛应用于人多能干细胞衍生细胞治疗产品。HEC检测的局限性主要包括两点：无法用于会产生影响未分化人多能干细胞存活的因子的细胞治疗产品，例如hiPSC衍生RPE细胞分泌的色素上皮衍生因子。这类产品中残留未分化人多能干细胞的潜在风险通常较低，但由于集落形成效率不足，无法通过加标实验确定准确检测限。不适用于人诱导多能干细胞衍生肾祖细胞，因为这类部分分化的细胞可在HEC检测的培养基中生长。
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