甾体皂苷是植物中一类重要的生物活性物质，因其结构多样性及多种生物活性，在食品、药品等领域备受关注。甾体皂苷的结构多样性主要源于其皂苷元骨架的差异，百合科葱属植物（如大葱、洋葱、大蒜）已被证实含有丰富的甾体皂苷元，如剑麻皂苷元、菝葜皂苷元等。葱属植物不仅是重要的调味食材，其摄入也被认为具有多种潜在健康益处，如改善食欲、滋养肠胃等。针对葱属植物中甾体皂苷元的系统研究，不仅可为建立科学的食品植物质量控制标准提供关键指标依据，也能为通过成分调控提升食用植物品质、推动功能性食品标准化开发奠定基础。
目前，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法是甾体皂苷元定性与定量分析最常用的技术，但面临旋光异构体分离难、检测灵敏度低的挑战。化学衍生化辅助LC-MS/MS技术作为改善其分离与检测性能的新兴策略，尤其是稳定同位素标记衍生技术，在提升分析灵敏度、准确度及定性定量效能方面展现出强大潜力，已在代谢物分析、生物标志物筛选及食品药物检测等领域显示出广阔应用前景。在甾体皂苷元分析中，吡啶作为衍生剂表现出显著优势：其可与甾体皂苷元的3-OH特异性反应引入永久带电基团，以改善分离行为，又能提升电离效率以增强MS检测响应；同时，作为电中性试剂，吡啶自身易通过前处理去除，不会对后续MS检测产生干扰；更重要的是，氘代吡啶衍生的标准品可作为稳定同位素内标，通过LC-MS/MS分析中D0/D5同位素对的匹配，有效补偿共洗脱组分导致的仪器漂移与基质效应，显著提升分析的准确度与选择性。尤其值得注意的是，氘代吡啶易获取、成本低，是极具优势的稳定同位素内标。
四川省疾病预防控制中心的薛莹、任琳*、雍莉*等以葱属植物为主要研究对象，创新性地建立了一种D0/D5-吡啶与Tf2O介导的稳定同位素标记衍生化策略，结合LC-MS/MS技术的分析方法。该策略借助D0/D5-吡啶作为衍生试剂的优势，在实现皂苷元3-OH位点特异性标记的同时，引入永久正电基团与稳定同位素内标，有效增强了目标化合物的分离度与质谱响应。通过系统的方法学验证与实际多样本分析，证实该方法可准确测定复杂基质中甾体皂苷元的含量。该方法的成功建立不仅为甾体皂苷元的检测提供了高准确度工具，其结合电荷标记与同位素内标的策略也为其他低电离效率天然产物的分析提供了新范式。
01
衍生物的鉴定和分离
甾体皂苷元的3位羟基（3-OH）在Tf2O的条件下与D0/D5-吡啶生成带有永久正电荷的N-烷基吡啶季铵化衍生物，见图1。通过Triple TOF 4600质谱仪在碰撞诱导解离条件下研究D0-和D5-吡啶标记的甾体皂苷元衍生物的MS碎裂行为。根据结果显示，D0-剑麻皂苷元衍生和D5-剑麻皂苷元衍生物具有相同的裂解途径，在质谱中形成m/z相差5 Da的同位素峰对（如m/z 478.366 3/483.396 9），见图2。在超高效液相色谱仪-QTRAP-MS/MS质谱仪的MRM模式下，由于D0与D5标记的衍生物具有高度一致的物理化学性质，它们在色谱上表现为共洗脱，保留时间偏差小于0.03 min。该同位素标记策略的核心优势在于，利用其高度一致的色谱行为，结合质谱的质量差异分辨能力，有效规避了复杂基质中其他共流出组分带来的信号干扰。
02
衍生化条件优化
为实现衍生化反应的高效性与条件温和性，本研究采用系统化策略对反应条件进行多维度优化。基于单因素变量试验设计，以衍生物的峰面积为量化指标，考察了反应温度及时间对反应效率的影响。
2.1时间优化
在室温下，衍生化反应时间分别设置为2、5、10、30、60 min。如图3A所示，目标化合物衍生化产物的特征峰面积在反应初期（＜10 min）随反应时间延长呈现显著增长趋势，表明反应在此阶段持续进行且转化率不断提高。值得注意的是，当反应时间达到10 min时，峰面积达到最大值。延长反应时间至30 min和60 min后，峰面积并未出现进一步显著提升，而是进入一个平台稳定期。这一现象清晰表明：在选定的室温及试剂浓度条件下，衍生化反应在10 min内即可基本完成。过长的反应时间不仅无法提高产率，反而可能因潜在的副反应或试剂分解而引入不必要的复杂性或增加分析周期。因此，10 min被确定为最优衍生化反应时间，兼顾了效率与分析通量。
2.2 温度优化
在确定最优反应时间的基础上，进一步评估了反应温度对衍生化效率的影响。按照标准衍生化流程处理样品，加入定量的衍生化试剂后，将反应体系分别置于4、20、30、45 ℃进行恒温衍生化反应，控制反应时间均为10 min，结果见图3B。在考察的温度范围内（4～45 ℃），目标衍生物的峰面积未观察到显著性差异（P＞0.05），无论是低温（4 ℃）下，还是在较高温度（45 ℃）下，反应在10 min峰面积也未出现异常升高或降低。这表明该衍生化反应具有较宽的温度适应范围和良好的温度耐受性。鉴于室温（20 ℃）操作最为简便、节能且易于控制，因此被确定为后续实验的最佳衍生化温度。
为进一步评估方法的实用性，考察了衍生化产物在模拟实际样品处理或存储条件下的稳定性。实验表明，将衍生化完成的样品溶液置于20 ℃避光条件下保存长达72 h后，目标衍生物的信号强度仍能保持高度稳定，其峰面积的相对偏差分别为：剑麻皂苷元衍生物0.8%、菝葜皂苷元衍生物1.6%（图3C）。这充分证明了衍生化产物具有良好的化学稳定性，能够满足复杂生物或环境样品分析中涉及的长周期、批量化处理或样品复测的需求。
03
色谱条件优化
本研究针对甾体皂苷元衍生物的分析，首先系统考察色谱柱和流动相体系的选择。在色谱柱筛选中，比较BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。结果表明，HSS T3柱对2 种甾体皂苷元衍生物展现出更强的保留能力、更好的分离度以及更高的检测灵敏度。在选定的HSS T3色谱柱上，考察4 种流动相体系（水/乙腈体系、水/乙腈（含0.1%甲酸水溶液）体系、水/乙腈（含2 mmol/L乙酸铵）体系、水/乙腈（含2 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸）体系）对分离效果的影响。结果表明，在含0.1%甲酸水溶液中添加乙酸铵可增强目标化合物的保留，改善色谱峰形，同时提高剑麻皂苷元衍生物和菝葜皂苷元衍生物的响应值及分离度。综上所述，本研究最终确定采用HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）作为色谱柱、水/乙腈（含2 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸）作为甾体皂苷元衍生物的最佳流动相体系。甾体皂苷元标准溶液衍生物在此优化条件下的定量离子监测色谱图见图4。
04
分析方法的验证
4.1 线性考察
取混合标准工作溶液衍生化，以甾体皂苷元的质量浓度为横坐标，以对应的D0-吡啶衍生物与D5-吡啶内标衍生物的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。如表2所示，剑麻皂苷元和菝葜皂苷元在线性范围内线性关系良好；决定系数（R2）均大于0.999 4。以目标峰的3 倍和10 倍信噪比（RSN）确定目标物的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果表明，剑麻皂苷元和菝葜皂苷元衍生物的LOD和LOQ均分别为0.2 ng/mL和0.5 ng/mL；较未衍生皂苷元LOD（4 ng/mL）降低了95%。
4.2 精密度
分别移取1.3.1节配制的5、50、200 ng/mL 3 个质量浓度水平的混合标准工作溶液，衍生后依据1.3.4节LCMS/MS分析条件进行分析。同一天内3 个质量浓度水平分别连续进6 次，考察日内精密度；每天进6 次，连续进3 d，考察日间精密度。结果显示，剑麻皂苷元衍生物和菝葜皂苷元衍生物峰面积的日内相对标准偏差（RSD）≤4.02%，日间RSD≤4.36%，表明仪器分析方法具有良好的精密度。
4.3 重复性
取同一葱属植物样品6 份，按照1.3.2、1.3.3节方法进行样品前处理，平行制备样品6 份。按照1.3.4节实验条件连续进样测定。根据峰面积测得剑麻皂苷元衍生物和菝葜皂苷元衍生物的RSD分别为1.76%、1.29%，表明此方法具有较高的可重复性和稳定性。
4.4 加标回收率
取同一葱属植物样品6 份，每份中精密加入剑麻皂苷元和菝葜皂苷元适量，在1.3.4节实验条件进行6 次平行测定，结果2 种目标甾体皂苷元衍生物的加标回收率范围为95.5%～104.2%，其对应的RSD均小于3.4%，表明方法准确度良好。
05
应用
该方法应用于测定大葱、小葱、洋葱和大蒜提取物的剑麻皂苷元和菝葜皂苷元，结果如表3所示。两种甾体皂苷元在葱属植物中呈现稳定的分布特征：其中大葱中剑麻皂苷元和菝葜皂苷元含量最高，分别为（464.2±41.0）ng/g和（614.8±61.6）ng/g；4 种葱属植物中的菝葜皂苷元含量都高于剑麻皂苷元，以大蒜最显著，菝葜皂苷元含量为（454.9±2.9）ng/g，而剑麻皂苷元为（252.3±20.8）ng/g。该结果为葱属植物中甾体皂苷元的分布规律研究提供了可靠数据，证实了方法在复杂植物基质分析中的实用性。
06
结论
本研究建立了一种基于D0/D5-吡啶稳定同位素标记衍生化LC-MS/MS分析方法，实现了葱属植物中甾体皂苷元（剑麻皂苷元、菝葜皂苷元）的高灵敏度、高准确度定量。该方法结合了电荷标记增强电离效率与同位素内标保障定量准确性的双重优势。与传统的未衍生化方法或普通衍生化方法相比，本策略的独特优势和必要性在于：1）解决了灵敏度瓶颈：通过电荷标记，将甾体皂苷元的电离效率提升了近一个数量级，使方法LOD低至0.2 ng/mL，较未衍生化方法降低了95%，从而能够有效检测食品基质中的痕量成分。2）攻克了准确定量难题：创新性地采用低成本氘代吡啶作为稳定同位素内标，有效补偿了从样品前处理到仪器分析全过程的变异与基质效应，使方法在复杂葱属基质中仍能保持优异的精密度（RSD≤4.36%）与加标回收率（95.5%～104.2%），解决了常规方法因缺乏合适内标而导致的定量不准问题。3）兼备了实用性与通用性：衍生化反应条件温和、快速且产物稳定，非常适合批量样品分析。该方法不仅为甾体皂苷元的精准痕量检测提供了可靠方案，其稳定同位素标记衍生化策略更是一种通用性强的创新方法，为其他低电离效率天然产物的分析提供了有效技术路径，在天然产物化学、功能性食品质量控制与开发等领域具有重要的应用价值。
引文格式：
薛莹, 侯月彩, 冷安芹, 等. 稳定同位素标记衍生化结合LC-MS/MS测定葱属食品中的甾体皂苷元[J]. 食品科学, 2026, 47(1): 205-211. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250804-027.
XUE Ying, HOU Yuecai, LENG Anqin, et al. Stable isotope labeling derivatization combined with LC-MS/MS for the determination of steroidal sapogenins in Allium vegetables[J]. Food Science, 2026, 47(1): 205-211. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250804-027.
实习编辑：唐豫英；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽农业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、安徽省农科院农产品加工研究所、皖西学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“ 第六届食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到） 在 中国 安徽 合肥 召开。
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