赭曲霉毒素A（OTA）是由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌产生的次级代谢产物，广泛污染谷物、咖啡、葡萄酒、香料及中药材等农产品。OTA具有强肾毒性、肝毒性、免疫抑制及致畸致癌性（2B类致癌物），对人类和动物健康构成严重威胁。在全球范围内，欧盟规定谷物中OTA限量为5 μg/kg，我国GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》限定谷物制品中OTA含量为5 μg/kg。
OTA快速检测对于保障食品安全具有重要意义。目前，OTA的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、免疫层析法等。传统OTA检测方法为色谱法，虽然准确性高，但前处理步骤复杂、设备昂贵以及对检测人员要求高。免疫分析法因操作简便、成本低、适用于现场筛查而成为研究热点。
纳米抗体源于驼科动物重链抗体的可变区，其分子质量仅15 kDa，与传统抗体相比，其具有较高亲和力、稳定性和易于基因工程改造等特性。目前，纳米抗体已在多种真菌毒素快速检测中得以应用。例如，融合碱性磷酸酶的纳米抗体针对OTA的酶联免疫吸附实验（ELISA）将检测时间缩短至20 min，其灵敏度较传统ELISA提高2.7倍。基于非竞争性均相荧光共振能量转移（FRET）免疫分析法的纳米抗体免疫传感器，能够在5 min内实现OTA/OTB的同步非竞争检测。高亲和力的纳米抗体是免疫层析快速检测技术的核心，然而目前关于OTA纳米抗体的制备及特性研究报道仍较少。
新疆第二医学院的徐睿君、方振华和刘洋*等通过科学设计在大肠杆菌中克隆表达高亲和力OTA纳米抗体，并系统探究纳米抗体的热温度性、pH值稳定性、对不同有机溶剂的耐受性等特性，同时分析OTA纳米抗体的结构及抗原结合的关键氨基酸位点，以期为食品安全检测提供核心材料，并为进一步推动免疫层析检测向绿色、超灵敏、多毒素联检方向发展奠定理论基础。
1
OTA纳米抗体的诱导表达
在优化条件下诱导表达纳米抗体并进行蛋白电泳验证，结果如图1所示。纯化得到的纳米抗体能与HRP标记抗HA鼠单抗特异性结合（IC50＝1.040 ng/mL），根据纳米抗体氨基酸序列推测其分子质量为14 kDa左右，与理论值一致，证明本实验制备得到目标纳米抗体。
2
OTA纳米抗体灵敏度分析
如图2所示，OTA纳米抗体对OTA的灵敏度IC50为1.040 ng/mL。
3
OTA纳米抗体特异性分析
OTA纳米抗体对4种毒素的抑制率IC50如图3所示。与OTA纳米抗体的灵敏度进行比较，其交叉反应率分析结果见表1。OTA纳米抗体对其他3种毒素的交叉反应率为由高到低依次为AFB1＞AFM1＞DON。结果表明，OTA纳米抗体对AFB1、AFM1、DON毒素无显著交叉反应（＜30%）。
4
OTA纳米抗体的热稳定性分析
如图4A所示，与对照组相比，在5～45 min期间纳米抗体与抗原的结合能力虽有波动但整体下降趋势较缓，在90 ℃处理45 min后仍具有85.9%左右的抗原结合能力；而从45 min到75 min时，抗原结合能力出现明显下降，尤其在60～75 min期间下降幅度较大，此时仅具有57.7%左右的抗原结合能力。结果说明，在90 ℃条件下，前期短时间处理对OTA纳米抗体的结合能力影响相对较小，随着处理时间延长并超过一定时间后，对其结合能力产生显著的负面作用。
采用5个处理温度（25、50、65、80、95 ℃）分别对纳米抗体进行5 min的处理，恢复至室温后进行间接ELISA。如图4B所示，随着温度的升高，OTA纳米抗体的抗原结合能力逐渐下降，在95 ℃处理5 min后仅具有25%左右的抗原结合能力，说明温度升高对OTA纳米抗体在450 nm波长处的吸光特性有负面作用，可能影响其结构或功能，进而降低OD值。
5
OTA纳米抗体耐酸碱性分析
如图5所示，在pH 5.0～7.4范围内，随着pH值的升高，抗体的IC50迅速下降。当pH值达到7.4时抗体IC50最小，表明其与OTA毒素的结合达到最高峰。IC50越小表明抗体与抗原的亲和力越高。随着pH值继续升高，抗体IC50又呈缓慢上升趋势，说明纳米抗体与OTA结合的亲和力开始下降。
6
OTA纳米抗体的离子强度耐受性分析
当离子浓度为5～100 mmol/L时，抗体灵敏度的IC50分别为2.432、1.671、1.045、2.784、2.185 ng/mL。由图6可知，在25 mmol/L条件下，纳米抗体展现出最优的灵敏度。当离子浓度升高至50～100 mmol/L时，OD450 nm显著下降，表现为ELISA反应中颜色显现迟缓且最终读数偏低。此现象充分表明，高离子强度环境不利于抗原-抗体结合反应，导致抗体活性受到一定程度抑制。
7
OTA纳米抗体对有机溶剂的耐受性
选取5种常见的有机溶剂（甲醇、乙腈、DMSO、DMF、丙酮）考察纳米抗体对有机溶剂的耐受性。共配制5个水平（10%、20%、40%、60%、80%）进行间接竞争ELISA分析，比较OTA纳米抗体在不同浓度有机溶剂条件下对OTA的结合能力。如图7所示，OTA纳米抗体对甲醇和丙酮的耐受能力最佳，而均不能耐受较高浓度的DMSO和DMF。
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OTA纳米抗体与毒素关键氨基酸分析
利用Discovery Studio软件进行分子对接分析，结果如图8所示。LYS45、GLU48、ARG40、ALA42、GLU91等氨基酸残基是纳米抗体与OTA结合的关键位点，表明它们在相互作用中起到重要作用。如表2所示，ARG40与UNK0的氢键距离为2.882 Å。由图8可知，纳米抗体与OTA之间存在氢键作用，氢键有助于维持复合物的稳定性和特异性。纳米抗体与OTA之间还存在其他非共价相互作用，如疏水相互作用、π-π堆积等，多种相互作用共同决定了OTA与纳米抗体的结合模式和亲和力。一般情况下，形成的相互作用越多、越强，结合模式越合理，复合物越稳定，这表明OTA纳米抗体与受体之间亲和力较高。通过观察OTA在这些氨基酸残基围绕空间中的位置和取向，可了解其在纳米抗体活性位点的结合模式，为深入理解两者相互作用机制、优化纳米抗体设计以及提升检测性能等提供结构基础。
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本研究成功在大肠杆菌表达系统中制备得到高灵敏度的OTA纳米抗体（IC50＝1.040 ng/mL），其在热稳定性、有机溶剂耐受性及特异性方面展现出显著优势。结合分子对接与功能验证，为纳米抗体在复杂食品基质中的检测应用提供了理论依据和技术支持。
本抗体的灵敏度（IC50＝1.040 ng/mL）已达到欧盟谷物OTA限值（5 μg/kg）的检测要求，但与近年超灵敏方法仍有差距。Nawaz等利用量子点免疫层析法测定OTA的检出限（limit of detection，LOD）为0.07 ng/L。Su Benchao等利用FRET纳米传感器测定OTA的LOD为5 pg/mL。Chen Guoxin等利用聚集诱导发光纳米探针检测OTA，其灵敏度IC50为0.149 ng/mL。灵敏度差异主要源于信号放大策略：本研究采用传统ELISA，而上述技术通过量子点荧光倍增或生物发光共振能量转移实现信号放大。本研究发现，OTA纳米抗体在高温环境下表现突出：90 ℃处理45 min后仍保留85.9%的抗原结合能力，远优于传统单克隆抗体（通常失活温度不高于70 ℃）。这与纳米抗体的单结构域特性相关，其缺乏轻链且互补决定区，通过二硫键稳定赋予其刚性结构。95 ℃处理5 min后结合能力骤降至25%，表明极端温度可能破坏β-折叠核心结构。
pH值与离子强度是食品检测中的关键干扰因素。抗体在pH 7.4时活性最佳，与谷物提取液常规pH值范围（6.5～7.5）匹配；但在酸性果汁（pH≈3.5）中可能失活，需添加缓冲液（如海藻糖稳定剂）维持其活性。离子强度实验表明，NaCl浓度超过50 mmol/L时会抑制结合，这与高盐环境削弱静电相互作用相关。可以通过在样品稀释液中添加0.5% BSA以屏蔽基质效应，或利用酵母表面展示系统高通量优化pH值稳定性。
在有机溶剂耐受性方面，该抗体在体积分数为40%甲醇、丙酮溶液中的活性损失小于20%，因此适用于含有机溶剂的谷物提取液检测。这与Chen Qi等的HRP-纳米抗体融合蛋白在体积分数20%甲醇溶液中的稳定性一致。然而，高极性溶剂（DMSO、DMF）会显著破坏氢键网络，导致体积分数为60%条件下的活性丧失超过80%，需在样品前处理中注意规避。
本研究通过Discovery Studio软件模拟揭示了OTA-纳米抗体的氢键与π-烷基作用协同结合机制，为理性设计提供了靶点。分子对接揭示了OTA结合的关键位点：LYS45和GLU48通过氢键直接锚定OTA苯丙氨酸基团，而ARG40和ALA42形成疏水口袋包裹氯代异香豆素结构。这种多重作用模式解释了高亲和力的分子基础。Wang Xuerou等通过丙氨酸扫描证实，Gly53/Ser102突变可使亲和力提升1.4倍。此外，可用噬菌体展示技术筛选耐有机溶剂突变体。
除此之外，本研究制备的纳米抗体还需与胶体金、时间分辨微球、量子点等标记物结合，进一步验证纳米抗体在实际OTA毒素检测中的应用可行性。
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结 论
本研究开发的OTA纳米抗体兼具高稳定性与特异性，其分子作用机制的解析为检测探针设计提供了新思路。通过融合信号放大技术（如量子点/生物发光）和抗体工程改造（多聚化/突变优化），该抗体有望成为现场检测食品中OTA污染的核心识别元件。
引文格式：
徐睿君, 方振华, 王琴, 等. 赭曲霉毒素A纳米抗体制备与抗体特性分析[J]. 食品科学, 2026, 47(6): 175-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250923-188.
XU Ruijun, FANG Zhenhua, WANG Qin, et al. Preparation and characterization of nanobodies against ochratoxin A[J].Food Science, 2026, 47(6): 175-181. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250923-188.
实习编辑：杨瑞蕾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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