人源化免疫系统小鼠（Human Immune System mice，HIS mice）被视为连接基础免疫学、疫苗评价和抗体药物开发的重要桥梁。理论上，这类小鼠在免疫缺陷背景下重建了来源于人造血干细胞的人类免疫系统，因而有机会在体内诱导人源B细胞应答，并直接产生全人源抗体。然而，长期困扰该领域的关键瓶颈是：尽管HIS小鼠能够重建相当数量的人源B细胞，这些B细胞在遭遇外源抗原后往往反应微弱，难以形成强烈的抗原特异性扩增、IgG类别转换和有效的效应B细胞分化。
近日，南京大学李颜团队在Advanced Science发表题为Optimization of B Cell Responses in Human Immune System Mice Through Organoid Based Screening的研究论文。该工作创造性地将来源于HIS小鼠的脾脏类器官体外筛选体系，与昂贵的免疫人源化小鼠体内模型相结合，系统解析并补足人源B细胞活化所缺失的“第二信号”，从而建立了一条优化HIS小鼠B细胞应答并开发全人源单克隆抗体的新路径。
这项研究的核心思路跳出了既往优化人B细胞功能的策略，即从根本上修复HIS小鼠中发育与激活受限的人源T细胞，而是从人B细胞应答所需的信号出发，提出“抗原预激活-第二信号补给”（antigen-primed second signal supplementation）策略：先让抗原特异性B细胞通过BCR获得第一信号，再在合适时间窗口外源补充T细胞通常提供的共刺激与细胞因子信号。通过这种方式，研究团队在HIS小鼠中成功促进抗原特异性B细胞扩增、浆细胞分化、IgG类别转换，并最终获得具有高亲和力和病毒中和活性的全人源单克隆抗体。
HIS小鼠B细胞反应弱的一个重要原因，被认为与人源T细胞帮助不足有关。在HIS小鼠中，人T细胞需要在小鼠胸腺环境中发育，同时还受到跨物种细胞因子不匹配、抗原递呈效率不足、淋巴器官结构发育不完善等多重限制，因此很难像人体内那样为B细胞提供连续而精准的帮助。换言之，B细胞并非完全不能启动，而是在接受抗原刺激后缺少决定其继续扩增、分化和类别转换的关键信号。
为找到这些缺失信号，李颜课题组首先建立了来源于HIS小鼠的脾脏类器官培养体系。该体系通过多细胞重聚集，在体外尽可能保留多种免疫细胞组成和B细胞存活环境，同时又能把昂贵、数量有限的HIS小鼠样本转化为可并行测试的筛选单元，大幅提高候选因子组合的多样性和评估效率。基于这一类器官平台，研究团队发现CD40L与IL-4是驱动人源B细胞扩增的关键组合，而IL-10和IL-21进一步促进浆细胞分化；由此确定CD40L + IL-4 + IL-10 + IL-21可作为促进B细胞活化和分化的基础第二信号组合。
不过，B细胞被激活并不意味着抗体应答已经真正成熟。研究人员随后发现，在上述第二信号作用下产生的浆细胞仍主要分泌IgM，IgG类别转换不足仍然存在。于是，作者继续利用类器官平台筛选炎症和天然免疫相关信号，发现TNF-α能够促进IgG转换，而TNF-α与CpG联合后可显著提高IgG阳性浆细胞比例。这个结果提示，理想的B细胞应答并不只依赖T细胞样第二信号，天然免疫激活信号同样是推动人源B细胞完成类别转换的重要模块。
进一步的动力学分析显示，B细胞扩增和终末分化对应不同的时间窗口。类器官实验中，B细胞扩增在早期达到高峰，而浆细胞分化和IgG转换发生得更晚。因此，研究团队将第二信号拆解为“扩增信号”和“分化信号”两个阶段：先给予以CD40L、IL-4和TNF-α为核心的扩增/转换支持，再在后续窗口补充IL-10、IL-21和CD40L以推动分化。相比一次性加入全部因子，分阶段、时序化的信号补给更接近体内T-B细胞互作的自然过程，也更有效地提升了浆细胞输出和IgG转换效率。
在体内验证中，研究人员以SARS-CoV-2 RBD蛋白为模式抗原免疫HIS小鼠，并采用CpG佐剂进行抗原预激活；随后通过尾静脉注射低剂量重组蛋白形式的第二信号，而非采用容易造成系统性炎症和非特异性B细胞活化的水动力质粒注射表达。优化后的时序给药方案显著诱导了RBD特异性B细胞扩增和分化，并产生可检测的RBD特异性IgG抗体。类似策略在OVA和PE等抗原模型中也显示出适用性，说明这一方法并非局限于单一抗原体系。
更重要的是，该体系不仅改善了HIS小鼠的免疫表型，还直接指向全人源抗体发现。作者从免疫后HIS小鼠中分选RBD特异性B细胞并进行BCR测序和重组抗体表达，获得了一批能够结合RBD的全人源单克隆抗体。部分抗体达到纳摩尔级亲和力；在优化方案后获得的D21抗体亲和力进一步提高，并且多株抗体在SARS-CoV-2假病毒中和实验中表现出明确中和活性，部分克隆的中和效果与之前报道的人源中和抗体B38相当或更优。
因此，这项工作的价值并不止于提高某一种HIS小鼠的B细胞应答强度，更在于提出了“脾脏类器官高通量筛选-信号模块解析-时序化方案优化-免疫人源化小鼠体内验证-全人源抗体获得”的完整研究范式。类器官体系作为前端筛选平台降低了珍贵HIS小鼠资源的消耗，并能快速找到可转化的信号组合；免疫人源化小鼠则作为体内验证和抗体来源模型，保留了人源B细胞在复杂生理环境中应答和被筛选的可能性。两者的结合，为利用HIS小鼠生产全人源抗体提供了更可标准化、可扩展的技术路线，也为全人源抗体的商业开发提供了一个新的先导抗体来源。
南京大学医学院模式动物研究所李颜教授为本文通讯作者。南京大学医学院模式动物研究所博士研究生孙海峤、李鹤为本文共同第一作者。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202524189
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