ADC的结构大家都很熟悉，由三部分构成：抗体、连接子、载荷。抗体通常以IgG骨架为基础，负责特异性识别细胞表面抗原，将药物精准递送至作用位点。连接子分为可裂解型与不可裂解型两类，连接载荷与抗体，同时决定药物在靶细胞内的稳定性与载荷释放效率。载荷多为高活性小分子药物，释放后作用于胞内特定靶点，相比单独使用游离载荷，可显著提升治疗窗口、降低脱靶毒性。
ADC分子结构与功能高度复杂，给生物分析工作带来巨大挑战。为完整表征ADC及体内生成的多种代谢分子，药物临床前与临床开发阶段均需搭建一套专属生物分析方法，以配套多种药物形式的检测，包括：1）两类ADC专属检测：偶联载荷检测、偶联抗体检测。偶联载荷检测指的是定量ADC分子上结合的载荷数量；偶联抗体检测则是定量任意结合有载荷的抗体分子，不区分载荷结合数量；2）总抗体（tAb）：包含全部已偶联、未偶联载荷的抗体分子；3）游离载荷：未与抗体共价结合的游离小分子药物。
自2013年Gorovits等人发布ADC生物分析重要文件以来，全球对ADC的科学认知、配套生物分析技术均实现跨越式发展。AAPS ADC工作组最新系统梳理了ADC生物分析主流思路与检测方法，覆盖总抗体、ADC完整分子、游离载荷定量，同时重点阐述药物抗体偶联比（DAR）测定、免疫原性评估、可溶性靶标对检测结果的干扰等内容，并发布了2026年新的白皮书，略作分享。
ADC及其各组分的定量检测方法
ADC涉及的主要检测组分是总抗、ADC完整分子和游离小分子载荷。不同组分常用的检测方法如下图所示，配体结合分析法（LBA）涵盖电化学发光免疫分析法（ECLIA）与酶联免疫吸附试验（ELISA），该类方法检测通量高、灵敏度优异，但捕获与检测步骤均需专用配套试剂。免疫捕获-液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）联用法对捕获试剂的要求更低，在选择性与特异性层面具备额外优势，代价是检测通量有所下降。液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）技术正被越来越多地用于ADC的定量检测。
ADC药物的生物分析策略必须充分考虑这类偶联药物在体内的动态变化特征——药物抗体偶联比（DAR）会随时间发生改变。充分掌握ADC药物的体内稳定性、清除代谢特征，以及药物潜在的免疫原性，是合理选择总抗体与ADC药物定量检测方法的重要前提。
总抗体检测
总抗体检测用于测定受试ADC药物所有循环存在的不同DAR亚型浓度，其中也包含完全脱偶联抗体（DAR=0）。免疫捕获- LC–MS/MS与LBA方法均可实现总抗体定量检测。
采用LBA时，可选用靶标抗原、抗独特型抗体（ID抗体）或抗Fc抗体作为捕获试剂，搭配配对的检测抗体完成信号读取。总抗用的配对试剂基本都是针对抗体端，不涉及载荷。不过，尽管捕获、检测试剂不会直接结合细胞毒性载荷，但载荷仍会产生空间位阻效应。需结合药物研发阶段、方法特异性、选择性以及试剂供应情况，综合评估捕获与检测试剂的适用性。无论最终选用何种试剂，在方法开发阶段均必须评估游离裸抗体与偶联抗体对检测结果造成的干扰。直白点讲，即使捕获和检测抗体均不涉及载荷，也要排除载荷对检测方法的影响。
采用LC–MS/MS开展临床前总抗体定量时，通用操作流程为胰蛋白酶酶切后，选取特征替代肽段进行定量检测。可根据所需检测特异性、待测ADC分子结构，选用不同关键捕获试剂。可通过protein A、protein G、抗人IgG抗体、靶抗原或抗独特型抗体对ADC药物进行亲和捕获；捕获完成后开展蛋白变性、还原处理，部分实验流程还会增设烷基化步骤。
常规使用胰蛋白酶或其他序列特异性蛋白酶进行蛋白水解，释放特异性特征肽段，作为总抗体定量的替代分析物。现已筛选出适用于多种临床前动物种属的通用胰酶肽段，例如IgG Fc区肽段：VVSVLTVLHQDWLNGK、GPSVFPLAPSSK、TTPPVLDSDGSFFLYSK。可变区来源肽段能够进一步提升定量方法的特异性与耐用性。理想的特征肽段应不存在酶切缺失位点，且无翻译后修饰干扰；条件允许时建议选取两段特征肽段，一段用于定量，另一段作为定性确证肽段。
大量文献证实，采用稳定标记通用内标（同位素标记肽段、侧翼肽段，即替代肽段两端额外增加氨基酸序列的肽段），能够显著提升检测准确度与精密度。有研究证实，在临床前检测流程中，使用Silumab这类通用单抗，可校正酶切效率差异与离子化基质效应。
临床样本总抗体定量普遍采用免疫捕获-液相色谱串联质谱联用法，以此提升检测特异性：首先利用靶标蛋白或抗独特型抗体对样本中全部总抗体进行亲和富集；富集后的样本经蛋白酶水解，释放高特异性替代肽段，再开展定量检测。
ADC完整分子定量检测
ADC完整分子药代检测指定量通过化学连接子结合至少1分子载荷、DAR≥1的抗体/抗体片段。检测方法对DAR的敏感度，由检测体系、配套试剂共同决定。
1.偶联载荷检测模式
LBA体系中常采用抗Fc、抗独特型、靶标介导捕获富集全部抗体分子，再通过载荷特异性检测产生信号。使用抗载荷抗体进行信号检测时，检测信号强度会随载荷结合数量提升而升高，因此该模式对DAR变化敏感；但空间位阻、抗原表位可及性、亲合力效应会削弱DAR响应灵敏度。
杂交LC-MS/MS实现DAR敏感检测的方式：捕获全部抗体分子后，通过酶解/化学手段释放结合载荷，以载荷定量结果间接表征偶联抗体浓度。
2.偶联抗体检测模式
LBA体系中以抗载荷抗体作为捕获试剂，搭配抗Fc/抗独特型抗体完成信号检测，适用于部分研究设计。该模式对DAR变化无响应，捕获抗体无法区分ADC分子上结合的载荷数量，给药后体内DAR发生改变时，检测浓度无法反映真实分子变化，存在明显局限性。
所以抗载荷抗体用于包被还是用于检测，所实现的检测目的是不同的哦。
除了LBA方法，行业内用LC-MS/MS定量完整ADC的趋势正在上升，优势体现在特异性强、可灵敏反映DAR变化，且无需制备抗载荷专属抗体。同时可开发一体化检测方案，同步定量ADC与总抗体，缩短检测周期，但会提升方法开发复杂度。
一体化检测实操流程：针对可裂解连接子ADC，捕获后等分样本，一份用于总抗体检测，另一份酶解/化学释放载荷完成ADC定量。常用酶解手段包括木瓜蛋白酶酶切、组织蛋白酶B裂解、化学释放载荷，以载荷作为ADC定量替代物；也可采用两步法：第一步特异性释放载荷，第二步胰蛋白酶酶切产生特征肽段完成总抗体同步检测。
LBA、LC-MS/MS均为ADC合规、常用检测平台。若捕获/检测试剂存在DAR响应偏差，会直接造成定量偏移。因此方法开发阶段，必须使用多组已知DAR分布的标准品、参考品，评估DAR对检测准确度、精密度、结果解读的干扰。
游离载荷定量检测
采用不可裂解连接子的ADC，体内游离载荷释放量极低。FDA指导原则明确要求：首次人体临床试验必须测定循环游离载荷暴露量，后期临床是否豁免该检测，需结合安全性数据综合判定。若高灵敏度检测方法下仍无法检出游离载荷，可考虑终止游离载荷常规监测。
LC-MS/MS是小分子游离载荷定量的核心平台，兼具超高灵敏度与特异性。血浆样本中游离载荷分离采用成熟小分子质谱前处理方案，包括蛋白沉淀（PP）、液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）。前处理全过程必须严格规避ADC体外脱偶联，否则会造成游离载荷定量虚高，产生检测偏差。该类前处理手段可有效分离游离载荷与血浆蛋白、各类基质干扰物。
载荷生物分析存在一些独特难点：ADC标准品本身含有纳克级至亚纳克级的游离载荷杂质，难以区分杂质与样本内真实游离载荷，下文有相关解决方案分享。
DAR分布定量检测
当前全球监管机构未强制要求生物分析方法测定单一DAR组分含量，但针对特定科学问题、风险评估场景，单一DAR组分检测具备极高决策价值，属于风险控制工具，如跨物种药代外推风险评估、早期连接子不稳定性风险排查、解释临床安全性信号、工艺可比性研究。
DAR分布是ADC关键质量属性，临床前、临床样本分析过程中建议持续监测，通过平均DAR数值表征连接子稳定性，建议在ADC开发早期完成全套表征。给药后样本ADC定量结果结合总抗体浓度，可计算平均DAR（如下图所示）。临床前动物体内给药后平均DAR动态曲线，可直观反映连接子体内稳定性，用于候选分子筛选排序。临床前、临床研究中均采用DAR变化趋势图追踪给药后体内平均DAR。首次人体临床研究完整表征DAR变化、明确连接子稳定性后，部分场景可豁免后续DAR持续检测，例如游离载荷系统暴露极低、总抗体与ADC浓度高度相关时。
行业通用指标为平均DAR，但部分场景下单独测定各DAR亚型（DAR0、DAR1、DAR2、DAR3、DAR4等），可更精细解析ADC体内异质性（如下图所示）。完整蛋白水平、HRMS可检出各DAR亚型信号偏移，包含偶联载荷数为0的裸抗（DAR0，无法通过偶联载荷LBA检出）；混合样本高分辨质谱方案可实现各单一DAR亚型准确定量。近年完整蛋白DAR测定新型技术快速发展：天然质谱、体积排阻色谱-天然质谱、天然反相液相色谱-质谱、混合疏水作用色谱-质谱联用。
免疫原性相关考量
ADC与所有蛋白类治疗药物一致，需评估机体免疫应答，明确免疫应答对药物药代动力学、长期安全性、临床疗效的影响。桥接型LBA是检测ADC抗药抗体（ADA）最主流方法。
现行监管指南要求采用多层级ADA生物分析策略：初筛实验、确证实验、滴度实验三层正交验证，确证实验剔除初筛假阳性结果，滴度实验量化免疫应答强度。简化层级方案的适用性需基于方法学数据综合评估，考察检测区间、灵敏度、特异性、药物耐受度；若关键性临床试验计划采用简化层级方案，建议提前与监管机构沟通确认。
ADC属于多结构域药物，需基于免疫原性风险评估，开展结构域特异性ADA分型、中和抗体（NAb）检测。产品相关免疫风险来源于抗体骨架、连接子、载荷或复合表位。从已上市ADC临床数据来看，ADC整体免疫原性风险未显著高于常规治疗性单抗。主要原因是已上市ADC均用于肿瘤适应症，患者前期多接受多线化疗，基线免疫功能偏弱，产生ADA的概率更低。
ADC可溶性靶标相关考量
ADC与可溶性脱落靶标在体内形成动态平衡，检测体系需区分三类分子：游离靶标、总靶标、靶标-ADC复合物。FDA指南明确：若靶标大量脱落并分泌至循环系统，需建立专属生物分析方法，区分游离ADC（未结合靶标）与靶标结合ADC。可溶性靶标会竞争性结合ADC，降低到达肿瘤部位的有效药物浓度，直接影响临床疗效。因此游离靶标定量数据可支撑有效给药剂量的临床决策。
LBA是可溶性靶标定量首选平台，游离靶标、总靶标检测方法开发需重点关注三点：1）靶标生物学特征：体内本底浓度低，对检测灵敏度要求极高；2）捕获、检测试剂选择，会改变体内靶标-ADC原有平衡；3）技术难点：优化实验条件，最大限度不扰动循环中已形成的靶标-ADC复合物。
游离靶标检测方法开发要点
捕获抗体亲和力应与ADC药物本身亲和力接近或更低。可考虑直接采用ADC药物作为捕获试剂，最大限度避免破坏样本原有平衡，防止游离靶标浓度高估。实验条件需要严格控制，比如降低样本稀释倍数、缩短孵育时长，减少平衡扰动。多数情况下体内ADC摩尔浓度远高于可溶性靶标，循环内游离靶标含量极低，定量结果无实际生物学参考价值，可酌情豁免游离靶标检测。
总靶标检测方法开发要点
动态范围是核心指标，总靶标数据可直观反映ADC给药后靶标蓄积水平。ADC半衰期普遍长于游离靶标，给药后形成的靶标-ADC复合物清除速率慢于游离靶标，提升了总靶标检测难度。总靶标检测需同时识别游离靶标、结合ADC的靶标，因此检测前需增加预处理步骤（如酸解离），解离复合物后再通过LBA定量。
实验前必须明确检测指标为游离靶标还是总靶标，结合研究目的判断方法适用性。若LBA总靶标方法开发失败，可切换LC-MS/MS平台搭建总靶标检测方案。
关键试剂相关考量
关键试剂是ADC全套生物分析方法的基础，从药物发现阶段贯穿至临床全周期。ADC分子结构复杂，需多套检测方法、配套试剂才能完整表征全部相关分子。无论采用LBA还是LC-MS/MS，关键试剂必须不受疾病基质干扰，具备不错的特异性。
药物发现、临床前阶段可选用商业化通用单抗、多抗作为关键捕获/检测试剂。选择正规供应商原料保证批次间一致性，同时必须完成全套适用性验证。
进入临床阶段后，需开发ADC专属特异性试剂，包括抗载荷抗体、抗独特型抗体。建议临床试验前至少一年，就启动临床级试剂制备项目，保障试剂按时供应。
试剂批次间重现性、长期稳定性直接决定多年临床项目中检测方法的稳健性；完整试剂表征需覆盖浓度、纯度、标记效率等核心属性。除理化、功能评价外，试剂需整合进整套检测方法，完成方法学确认，才能保障项目顺利推进。
新批次试剂制备完成后，条件允许时需开展单方法桥接验证，对比新旧批次试剂检测结果。建议大批量一次性制备、标记试剂，减少批次更换频次。严格管控储存条件，任何储存偏差都会破坏试剂完整性、降低检测性能。
样本稳定性相关考量
ADC稳定性受抗体偶联化学工艺、连接子化学不稳定性共同影响。不可裂解连接子体内稳定性整体优于可裂解连接子，体内游离载荷释放水平更低。
样本前处理全过程可能引发ADC体外脱偶联，载荷释放速率受多重变量调控：光敏感性、物种特异性酶活性、基质pH、溶血干扰。药物开发早期开展全套稳定性考察，可为毒理、临床样本采集、前处理流程制定规范。
案例：DXd类喜树碱衍生物载荷稳定性
DXd载荷具备光敏感性，生物分析全程样本处理需特别关注这一风险。DXd存在pH依赖性环结构转化：活性内酯环在碱性环境下转化为无活性羧酸盐，低pH（＜6.0）条件下DXd ADC降解速率显著放缓。
避光条件管控：波长530nm以上LED光源造成的降解可忽略；琥珀色瓶、环烯烃聚合物样品瓶避光保护效果优于透明玻璃瓶。
载荷稳定性考察通用方案：制备空白基质、低浓度质控、高浓度质控基质样本，同时加入近似峰浓度（Cmax）的ADC标准品。设置两组对照：一组仅载荷质控、一组ADC共存载荷质控，零点理论浓度校正ADC原料自带游离载荷杂质。两组质控样本同步放置于各类稳定性条件下考察。若检出体外脱偶联，需配套对应规避方案，如超低温（-70℃）储存、基质添加酸性缓冲液/抗氧化剂、提取全程冰浴操作。
分阶段ADC生物分析完整策略
药物开发全周期中，药代/吸收、分布、代谢、排泄（ADME）研究目标持续变化，生物分析方案需匹配对应开发阶段。
1. 药物发现阶段
ADC生物分析核心目标：获取临床前物种药代、药效、毒性数据，支撑候选分子筛选。核心检测分析物：总抗体、完整ADC、游离未偶联载荷、活性载荷代谢产物、DAR分布。若异常药代提示抗药抗体介导清除，同步启动ADA检测。
发现阶段检测方法以“适配研究需求”为核心，优先保证检测灵活、快速交付数据。
2. GLP毒理学研究阶段
核心目标：提升数据完整性、重现性、监管合规性。ADC毒理实验通常同时开展啮齿类、非啮齿类动物研究，所有支撑GLP研究的生物分析方法必须完全按照M10指南完成全套方法学验证。本阶段精简检测分析物，仅保留能够解释系统暴露、毒性结果的核心指标。
3. 临床早期开发阶段
持续采用经验证检测方法测定ADC全套分析物，支撑安全性评估、暴露量特征表征。
4. 临床后期开发阶段
精简检测范围，仅保留与暴露-效应关系、监管决策高度相关的分析物。例如：高灵敏度方法未检出游离载荷，可后续豁免游离载荷常规检测；若总抗体与ADC浓度高度线性相关，且抗体仅作为递送载体，可取消总抗体持续定量检测。
除分析物筛选外，检测平台、关键试剂随开发阶段同步迭代：从商业化通用试剂过渡至抗独特型专属试剂，从探索性检测体系升级为完全验证的LBA/LC-MS/MS标准方法。开发过程中若更换检测平台、关键试剂，需开展正式可比性验证，保障药代数据解读连续性。
LC-MS/MS分子特异性优势突出，但低浓度临床样本下LBA灵敏度更优；因此检测平台选择需结合分子特性、开发阶段综合判定。
下表汇总了试剂制备流程、分阶段检测方法选择全流程。
申报注册配套ADC生物分析考量
生物基质中ADC及其各组分准确定量，是获取关键药代动力学参数、支撑药物安全性与有效性监管决策的基础。所有生物分析方法必须完成完整开发、验证、规范记录，保证数据可靠性，用于各国药品注册申报。
监管指导文件明确：自首次人体临床试验起，ADC及其各组分必须采用经验证方法完成定量。临床后期开发阶段，需定量循环内可检出的ADC、各组分、活性载荷代谢产物，完整表征单一组分药代特征，支撑暴露-效应关系分析。全部生物分析方法开发、验证、样本分析流程，均需严格遵循FDA《M10生物分析方法验证与研究样本分析》指南要求。
多数ADC载荷为高活性细胞毒性分子，半数抑制浓度（IC50）仅pmol至nmol级别，游离载荷微小浓度波动即可显著改变药物安全性特征。FDA指南明确：游离载荷检测方法灵敏度必须足以捕捉系统暴露量微小变化。游离载荷定量下限（LLOQ）需结合载荷活性、作用机制、毒性分布特征综合确定。超高活性载荷需达到亚ng/mL（常为10–50pg/mL）定量下限，检测灵敏度至少高于毒性相关浓度10倍。皮克级定量下限带来技术挑战，但超高效液相色谱、高灵敏度检测器等LC-MS/MS技术迭代，已逐步解决该检测难点。
引自：10.1208/s12248-026-01268-1
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