2026年7月11日，浙江中医药大学附属浙江省立同德医院李清林团队、浙江省肿瘤医院贾兴团队等，在Phytomedicine （中科院1区，TOP期刊，IF=11.3）在线发表题为“Total Glucosides of Paeony modulates leucine metabolism by inhibiting SLC7A5, antagonizing mTOR signaling to suppress head and neck squamous cell carcinoma”的研究论文。该文于2026年1月21日投稿，2026年7月6日修回，2026年7月9日接收。
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）具有复发、转移和治疗耐受等临床难题。该研究聚焦天然药物活性提取物白芍总苷（TGP），系统评估其对HNSCC细胞增殖、迁移、上皮-间质转化和凋亡的影响，并结合转录组测序、WGCNA、LASSO机器学习、单细胞RNA测序、分子对接、HPLC成分验证、异种移植瘤和同系小鼠模型，解析其潜在抗肿瘤机制。
研究发现，TGP可下调氨基酸转运蛋白SLC7A5，减少细胞内亮氨酸摄取，进一步降低亮氨酸代谢产物α-酮异己酸（KIC）水平，并抑制mTOR/ULK1/S6K信号通路，从而限制HNSCC细胞增殖和迁移。SLC7A5过表达或mTOR激活剂MHY1485可削弱TGP的抑制作用，而SLC7A5敲低则可模拟TGP的抗肿瘤表型。动物实验还提示，TGP在抑制肿瘤生长的同时可改善免疫抑制性肿瘤微环境。需要注意的是，该研究主要基于细胞实验和小鼠模型，不能直接等同于人体临床疗效。
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【摘 要】
背景：头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全球重要健康挑战之一，其特点包括患者生存率较低、转移发生频繁。传统治疗常受到全身毒性和耐药性的限制，因此，白芍总苷（Total Glucosides of Paeony，TGP）等天然生物活性提取物被认为具有潜在治疗价值。氨基酸转运蛋白SLC7A5已被证明可通过促进亮氨酸摄取并激活mTOR信号通路来驱动肿瘤增殖，但TGP与HNSCC中SLC7A5/mTOR轴之间的具体关系尚未完全阐明。
目的：本研究旨在评价TGP对HNSCC的抑制作用，并探讨其潜在分子机制。
方法：研究采用人源HNSCC细胞系CAL27、FADU和小鼠HNSCC细胞系SCC7，通过多维表型实验评价TGP的抗肿瘤作用，其中包括Western blot检测上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物。研究进一步结合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）以及单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）筛选核心靶点，并通过分子对接进行结构模拟，再利用患者组织芯片进行验证。体内研究则在多个细胞来源异种移植瘤和同系小鼠模型中评价剂量-反应关系及救援实验，并结合下游代谢检测和免疫表型流式分析。
结果：TGP可剂量依赖性抑制HNSCC细胞增殖、迁移和EMT进程，同时诱导细胞凋亡。体内实验中，TGP在三种细胞来源模型中均可限制肿瘤体积和重量，且未观察到明显系统性细胞毒性。转录组测序结合WGCNA和LASSO分析确定SLC7A5是TGP作用于HNSCC的重要靶点。机制上，TGP抑制SLC7A5及其下游亮氨酸代谢酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表达，从而降低代谢物α-酮异己酸（α-ketoisocaproate，KIC）水平，并关闭mTOR信号级联。SLC7A5敲低可复制TGP产生的治疗表型，而SLC7A5过表达或mTOR激动剂MHY1485可有效削弱这些效应。此外，TGP还可在体内重塑免疫抑制性肿瘤微环境。
结论：TGP通过靶向SLC7A5降低亮氨酸摄取，从而抑制mTOR信号轴活性，进而抑制HNSCC增殖。
01
研究背景及科学问题
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）主要发生于头颈部黏膜上皮组织，例如口腔、咽部和喉部，是全球常见恶性肿瘤之一。近年来，HNSCC治疗策略已逐渐从传统手术联合放化疗，转向包含靶向治疗、免疫检查点抑制剂和细胞治疗在内的综合治疗模式。然而，患者总体生存改善仍不理想。局部晚期HNSCC患者5年生存率仍约为50%，且超过半数患者在接受根治性同步放化疗后出现局部复发或远处转移，给临床治疗带来巨大挑战。
当前HNSCC治疗仍面临多重限制。首先，放疗和化疗对正常组织的损伤限制了治疗剂量强度，导致疗效不足。其次，以PD-1抑制剂为代表的免疫检查点阻断疗法虽然带来一定希望，但在铂耐药复发/转移性HNSCC中的应答率仍然较低。第三，即使将抗EGFR单克隆抗体等靶向治疗纳入标准治疗方案，患者获得的生存获益仍有限，且最终不可避免出现耐药。因此，探索替代或辅助治疗策略具有重要意义。
天然植物来源生物活性成分因具有多靶点、多通路调控能力以及相对较好的安全性，正成为越来越受关注的研究方向。白芍总苷（TGP）是从芍药Paeonia lactiflora Pall.干燥根中提取的活性成分复合物，主要由单萜苷类成分组成，包括芍药苷、白芍内酯苷、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷等，其中芍药苷约占60%—90%。现代药理学研究显示，TGP具有多种生物活性，包括抑制自身免疫反应、调节免疫平衡和抑制肿瘤细胞增殖等。然而，TGP在HNSCC中的研究仍较少。作者认为，TGP在HNSCC治疗中可能通过调节肿瘤微环境和抑制肿瘤增殖发挥抗肿瘤效应，但其具体机制仍需进一步明确。
溶质载体家族7成员5（solute carrier family 7 member 5，SLC7A5），又称L型氨基酸转运蛋白1（L-type amino acid transporter 1，LAT1），是一种定位于细胞膜的大型中性氨基酸转运蛋白。SLC7A5是必需氨基酸进入细胞的重要通路，可介导亮氨酸、谷氨酰胺和芳香族氨基酸等物质跨膜转运。在肿瘤微环境中，SLC7A5常出现异常高表达，并已在乳腺癌、肺癌、结直肠癌和胆囊癌等多种恶性肿瘤中被检测到高水平表达。
既往研究表明，SLC7A5高表达可显著增强肿瘤细胞摄取必需氨基酸的能力，为肿瘤快速生长和增殖提供营养基础。肿瘤细胞高度依赖SLC7A5介导的氨基酸转运，即使在营养受限的肿瘤微环境中，也能够获取必需氨基酸，维持恶性生长和增殖活性，从而获得独特的生存优势。
亮氨酸是一种关键营养信号分子，可通过SLC7A5进入细胞。亮氨酸与感受蛋白Sestrin2结合后，可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信号通路。mTORC1是调控细胞合成代谢的重要通路，可通过两条途径促进蛋白质合成：一是通过磷酸化使真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）失活，二是通过磷酸化激活核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）。mTORC1参与细胞信号转导，调节营养合成、细胞增殖和血管生成，最终推动肿瘤细胞异常增殖。SLC7A5过表达的肿瘤细胞通常具有更强的亮氨酸摄取能力，过量亮氨酸进一步激活mTOR信号通路，加速细胞周期进展并促进肿瘤细胞恶性增殖。
本研究系统考察TGP对HNSCC的抑制作用及其潜在机制。研究结果提示，TGP可通过下调SLC7A5表达，降低细胞内亮氨酸水平，从而抑制mTOR信号通路并发挥抗HNSCC作用。
02
重要发现及亮点
TGP抑制HNSCC细胞增殖、迁移和EMT，并诱导凋亡
研究首先检测TGP对HNSCC细胞的影响。结果显示，TGP在不同HNSCC细胞系中的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为：CAL27细胞1659 μg/mL、FADU细胞1145 μg/mL、SCC7细胞802.9 μg/mL。基于这些结果，研究设置不同的低剂量和高剂量TGP处理浓度用于后续实验。
CCK-8实验显示，TGP可剂量依赖性抑制HNSCC细胞增殖。EdU染色进一步表明，随着TGP浓度升高，代表增殖细胞的绿色荧光信号逐渐减弱。克隆形成实验也显示，TGP显著降低HNSCC细胞形成克隆的能力，说明其可有效抑制细胞增殖。
随后，研究采用Transwell迁移实验和划痕实验评估TGP对HNSCC细胞迁移能力的影响。结果显示，TGP处理48小时后，迁移细胞数量显著减少，并呈浓度依赖趋势。划痕实验也支持这一结果。在分子水平上，TGP降低间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达，提示TGP可抑制EMT过程。此外，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示，TGP处理可诱导明显细胞凋亡。为排除非特异性培养环境因素干扰，研究还检测了含不同浓度TGP培养基的pH值和渗透压，发现TGP未显著改变培养基pH和渗透压。
图1：TGP抑制HNSCC细胞增殖、迁移，并诱导细胞凋亡。（A）CAL27、FADU和SCC7细胞经溶剂对照（Control）、低剂量TGP（TGP-low）和高剂量TGP（TGP-high）处理后，通过CCK-8实验检测细胞增殖曲线。（B）EdU掺入实验代表性图像，显示不同处理条件下的增殖细胞；绿色表示EdU，蓝色表示Hoechst。（C）克隆形成实验显示HNSCC细胞的克隆存活能力。（D）Transwell迁移实验显示TGP处理后细胞迁移减少。（E）Western blot分析EMT标志物N-Cadherin和Vimentin，β-ACTIN作为上样内参。（F）HNSCC细胞经Annexin V-FITC/PI染色后进行流式细胞术凋亡分析，并对凋亡率进行定量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
SLC7A5被确定为TGP抑制HNSCC的重要靶点
为探索TGP抑制HNSCC的潜在机制，研究对TGP或PBS处理48小时后的HNSCC细胞进行转录组测序。通过DESeq2标准化差异表达分析，比较不同处理组之间的基因表达变化。研究将高剂量TGP相对对照组下调基因、低剂量TGP相对对照组下调基因，以及高剂量TGP相对低剂量TGP进一步下调基因取交集，最终获得77个TGP相关基因。
为识别与HNSCC直接相关的基因，研究下载TCGA-HNSC转录组数据，其中包括520个肿瘤样本和44个正常样本，并采用WGCNA构建基因共表达网络。分析显示，绿色模块包含609个基因，与肿瘤表型具有最高绝对相关系数，因此被定义为HNSCC肿瘤相关关键模块。KEGG富集分析显示，该模块基因与代谢通路、PI3K-AKT通路、MAPK信号通路和mTOR通路相关。
随后，研究对绿色模块中的基因进行LASSO机器学习回归筛选，最终识别出33个候选基因。进一步通过Cox回归分析建立由10个基因构成的预后特征，包括PTK7、GNA12、VDR、SLC7A5、EXTL3、COL4A5、KLF7、FADS3、RRAGD和SEMA4D。该风险模型可区分高风险和低风险患者，高风险组死亡率更高、生存时间更短。模型在1年、3年、5年和10年总体生存预测中的AUC分别为0.64、0.69、0.59和0.73。
最后，将LASSO筛选基因与TGP相关基因交叉分析，获得两个关键基因：SLC7A5和SLC3A2。SLC7A5是重要氨基酸转运蛋白，可与SLC3A2通过二硫键形成异二聚体，维持其细胞膜定位并执行氨基酸转运功能。在TCGA-HNSC数据库中，SLC7A5在肿瘤组织中高表达。生存分析显示，SLC7A5高表达患者生存时间显著短于低表达患者。GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591四个外部数据集也一致验证了SLC7A5在HNSCC肿瘤组织中较正常组织显著升高。
组织芯片免疫组化进一步证实，SLC7A5蛋白在HNSCC肿瘤组织中较配对癌旁正常组织明显上调。根据KI-67和SLC7A5染色强度对HNSCC标本进行分层后，研究观察到二者表达存在一致趋势：SLC7A5低表达组织中KI-67阳性较少，而SLC7A5高表达组织中KI-67阳性增殖细胞明显增多。这提示SLC7A5高表达与HNSCC肿瘤细胞高增殖状态密切相关。
图2：SLC7A5是TGP抑制HNSCC的重要靶点。（A）实验流程图。（B）差异表达基因火山图。（C）77个TGP相关基因的筛选过程。（D）WGCNA分析。（E）KEGG分析。（F）LASSO回归分析。（G）LASSO筛选基因与TGP相关基因集（TRGS）的交叉分析。（H）TCGA-HNSC数据库中SLC7A5表达分析。（I）TCGA-HNSC数据库中SLC7A5的生存分析。（J）GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591数据库中SLC7A5表达分析。
单细胞转录组揭示HNSCC中SLC7A5的细胞类型特异性上调
虽然bulk转录组已证实SLC7A5在HNSCC中的总体上调及预后意义，但整体测序平均效应可能掩盖肿瘤内部异质性和不同细胞类型中的分布差异。为在单细胞水平解析SLC7A5表达结构，研究分析了GSE181919单细胞RNA测序数据集，该数据集包含HNSCC病灶及正常对照组织中大量单细胞转录组信息。
无监督聚类和UMAP可视化将肿瘤微环境中的细胞分为12类细胞谱系，包括B细胞、浆细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、增殖性T细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、脂质相关巨噬细胞和肥大细胞。各细胞类型身份通过经典谱系标志物表达得到验证。与正常组织相比，肿瘤组织中的细胞组成发生明显重塑，其中上皮细胞等细胞群比例发生变化。
SLC7A5表达具有明显异质性。整体来看，SLC7A5在多种基质细胞中基线表达较低，但在T细胞亚群中相对富集，尤其是在CD4+和CD8+ T细胞中更明显。进一步比较正常与癌组织显示，SLC7A5在恶性来源上皮细胞和肿瘤浸润CD8+ T细胞中选择性且显著上调。
研究还将癌组织中的恶性上皮细胞分为SLC7A5高表达和低表达亚群进行富集分析。结果显示，SLC7A5高表达亚群富集G2M检查点、EMT、血管生成、缺氧和胆固醇稳态等高增殖和侵袭性肿瘤特征，同时伴随部分代谢处理通路抑制。KEGG分析进一步显示，上调基因富集于细胞周期、黏着斑和癌症蛋白聚糖等通路。GO细胞组分分析显示，SLC7A5高表达与细胞-基质连接、黏着斑、纺锤体和染色体区域等结构相关过程增强有关，提示其与肿瘤细胞有丝分裂和结构重塑密切相关。
图3：单细胞RNA测序分析揭示人HNSCC组织中SLC7A5表达具有细胞类型特异性。（A）UMAP图显示数据集中所有细胞的细胞类型注释。（B）热图显示已鉴定细胞类型中标志基因表达情况。（C）UMAP图比较正常组织（NL）和癌组织（CA）之间的细胞类型分布。（D）柱状图显示NL组和CA组中各细胞类型的相对比例。（E）UMAP图显示SLC7A5表达细胞的分布。（F）小提琴图显示不同细胞类型中SLC7A5表达水平。（G）UMAP图显示NL和CA组织中SLC7A5表达情况。（H）小提琴图比较NL组和CA组中上皮细胞（左）及CD8+ T细胞（右）的SLC7A5表达。
TGP在体内外下调SLC7A5并抑制亮氨酸代谢
Western blot和qRT-PCR结果显示，TGP可剂量依赖性降低CAL27、FADU和SCC7细胞中SLC7A5蛋白和mRNA表达。鉴于SLC7A5是大型中性氨基酸，尤其是亮氨酸摄取的主要功能转运蛋白，研究进一步检测细胞内亮氨酸含量。结果显示，TGP显著耗竭细胞内亮氨酸池，说明TGP介导的SLC7A5抑制确实会削弱HNSCC细胞营养摄取。
为了判断SLC7A5抑制导致的亮氨酸摄取下降是否会影响下游代谢处理，研究检测支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）分解代谢级联关键组分。TGP显著降低支链氨基酸转氨酶1（BCAT1）以及支链α-酮酸脱氢酶复合物核心亚基BCKDHA和BCKDHB的蛋白表达。与此一致，亮氨酸经BCAT1转氨生成的直接下游代谢物KIC在TGP处理后呈剂量依赖性降低。
体内实验方面，研究建立CAL27和FADU来源异种移植瘤模型。肿瘤照片、生长曲线和肿瘤重量均显示，TGP可在两种模型中剂量依赖性抑制肿瘤生长。Ki-67和SLC7A5免疫组化进一步证实，TGP可抑制肿瘤组织增殖并降低SLC7A5表达。肿瘤组织Western blot也验证了TGP对SLC7A5蛋白表达的抑制作用。肿瘤组织亮氨酸水平热图显示，TGP在体内同样明显降低亮氨酸积累。
研究还采用人SLC7A5高分辨率冷冻电镜结构（PDB: 8XPU）进行虚拟筛选和分子对接，以阐明TGP活性成分与SLC7A5之间的直接结合关系。基于既往质谱和SwissADME分析确定的21种TGP药物样成分，结果显示三种主要单萜苷类成分——苯甲酰芍药苷、芍药苷和白芍内酯苷——与SLC7A5表现出较强结合潜力，结合能分别为−12.234 kcal/mol、−11.036 kcal/mol和−10.832 kcal/mol。三维对接模型和二维相互作用图显示，这些成分可稳定结合SLC7A5功能性底物结合口袋，并与PHE-252、ALA-253、TYR-254、ASN-404、ILE-63、GLY-65和SER-66等关键氨基酸残基形成氢键和疏水作用。
为验证计算预测并确认TGP化学组成，研究进一步开展HPLC分析。TGP在230 nm下呈现多峰特征色谱图。通过与标准品保留时间比较，研究确认TGP样品中存在分子对接排名靠前的三种成分：芍药苷、苯甲酰芍药苷和白芍内酯苷。这不仅验证了TGP样品的化学组成和质量，也从实验层面证实预测的活性成分确实存在于该草药混合物中。
在免疫完整环境中，研究进一步建立SCC7同系皮下肿瘤模型。与CAL27和FADU异种移植瘤结果一致，TGP显著降低肿瘤体积和重量。流式细胞术显示，TGP显著降低区域淋巴结和原发肿瘤组织中SLC7A5平均荧光强度。肿瘤微环境免疫表型分析显示，TGP可将免疫抑制性生态位重塑为更活跃的抗肿瘤表型，表现为功能性CD4+和CD8+ T细胞、M1巨噬细胞（CD11b+F4/80+CD86+）浸润增加，同时促肿瘤Treg细胞（CD4+CD25+FOXP3+）和M2巨噬细胞（CD11b+F4/80+CD206+）减少。腹股沟淋巴结中效应CD4+和CD8+ T细胞也扩增，而Treg比例下降。主要器官H&E染色未观察到明显组织学损伤，支持TGP在该实验条件下具有较好的体内安全性。
图4：TGP在HNSCC异种移植瘤模型中抑制肿瘤生长、下调SLC7A5表达并降低亮氨酸水平。（A）CAL27、FADU和SCC7细胞经溶剂对照（Control）、低剂量TGP（TGP-low）或高剂量TGP（TGP-high）处理后，SLC7A5蛋白表达的Western blot分析，β-ACTIN作为上样内参。（B—C）在相同处理条件下，三种细胞系中SLC7A5 mRNA表达的qRT-PCR定量分析。（D）TGP处理后，CAL27、FADU和SCC7细胞培养上清中亮氨酸浓度。（E、H）CAL27（E）和FADU（H）异种移植瘤小鼠经溶剂、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg处理后，剥离肿瘤的代表性图像。（F、I）CAL27（F）和FADU（I）异种移植瘤模型中，肿瘤体积随时间变化的生长曲线。（G、J）CAL27（G）和FADU（J）异种移植瘤实验终点测得的肿瘤重量。（K、L）CAL27（K）和FADU（L）肿瘤组织中Ki-67（增殖标志物）和SLC7A5免疫组织化学染色。（M）CAL27和FADU异种移植瘤组织中SLC7A5蛋白表达的Western blot分析。（N）热图显示CAL27、FADU和SCC7异种移植瘤组织在不同处理条件下的亮氨酸浓度。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图5：白芍总苷（TGP）及其标准品的HPLC化学谱图。（A）TGP在230 nm下的HPLC色谱图，显示该草药混合物的特征化学谱图。图中标注了对应三种已鉴定植物化学成分的峰。（B—D）标准品HPLC色谱图：（B）芍药苷（保留时间RT=7.74 min）；（C）苯甲酰芍药苷（RT=11.77 min）；（D）白芍内酯苷（RT=7.55 min）。TGP混合物与标准品之间的保留时间匹配确认了这些植物化学成分的身份。色谱条件：C18柱，20 min内5%—98% B梯度洗脱，230 nm检测，进样体积10 μL。
SLC7A5过表达可逆转TGP对HNSCC的抑制作用
为验证TGP是否通过下调SLC7A5抑制HNSCC，研究开展SLC7A5过表达补偿实验。细胞分为四组：G1为Control组，转染1 μg/mL对照质粒；G2为TGP组，转染对照质粒后接受TGP处理48小时；G3为OE-SLC7A5组，转染1 μg/mL SLC7A5过表达质粒；G4为OE-SLC7A5+TGP组，转染SLC7A5过表达质粒后再接受TGP处理48小时。
mRNA和蛋白结果显示，G3组较G1组显著上调SLC7A5表达；G4组较G2组也显著提高SLC7A5表达，提示SLC7A5表达获得部分恢复。功能实验显示，G3组较G1组显著增强HNSCC细胞增殖、克隆形成和迁移能力；而G4组较G2组也明显恢复这些生物学特性。SLC7A5过表达还显著增加细胞内亮氨酸含量，G4组较TGP单独处理组亮氨酸水平明显回升。
由于细胞内亮氨酸是激活mTOR信号轴的重要上游触发因素，研究进一步检测mTOR/ULK1通路。结果显示，TGP诱导的mTOR/ULK1通路抑制在SLC7A5过表达后明显被重新激活，表现为p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平恢复。TGP对EMT过程的阻断也在SLC7A5上调后被逆转。上述结果表明，SLC7A5异位过表达可抵消TGP对HNSCC细胞的内在抑制效应。
体内验证方面，TGP在CAL27、FADU和SCC7模型中均可剂量依赖性抑制肿瘤组织中mTOR、ULK1和S6K磷酸化。随后，研究在FADU异种移植瘤模型中进行体内救援实验。肿瘤形态、肿瘤体积曲线和终点肿瘤重量均显示，SLC7A5过表达显著削弱TGP的治疗效应，使肿瘤生长明显恢复。免疫组化显示，与TGP单独处理相比，OE+TGP组SLC7A5免疫反应和Ki-67增殖指数均明显恢复。肿瘤组织Western blot也证实，SLC7A5过表达可恢复被TGP压低的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K水平。这些结果说明，TGP在体内的抗肿瘤活性依赖其对SLC7A5/mTOR信号轴的干扰。
图6：SLC7A5过表达逆转TGP对HNSCC的抑制作用。（A）四个实验组示意图：G1，Control；G2，TGP处理；G3，SLC7A5过表达（OE-SLC7A5）；G4，SLC7A5过表达联合TGP处理（OE-SLC7A5+TGP）。（B）CAL27、FADU和SCC7细胞中SLC7A5蛋白表达的代表性Western blot图像（左）及相应定量分析（右）。GAPDH作为上样内参。（C）CCK-8实验检测四种处理条件下HNSCC细胞增殖曲线。（D）克隆形成实验显示HNSCC细胞克隆存活能力。（E）Transwell迁移实验显示HNSCC细胞迁移能力。（F）不同处理条件下CAL27、FADU和SCC7细胞培养上清中的亮氨酸浓度。（G）mTOR/ULK1通路关键蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot图像，GAPDH作为上样内参。（H）热图显示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/总蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7：SLC7A5过表达在HNSCC异种移植瘤模型中挽救TGP的抗肿瘤效应。（A）CAL27、FADU和SCC7细胞经溶剂对照（Control）、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg处理后，mTOR通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot图像。GAPDH作为上样内参。（B）四组小鼠剥离肿瘤的代表性图像：Control、TGP、OE-SLC7A5和OE-SLC7A5+TGP（OE+TGP）。（C）四个处理组中肿瘤体积随时间变化的生长曲线。（D）实验终点测得的肿瘤重量。（E）四组肿瘤组织中SLC7A5和Ki-67免疫组织化学染色。（F）四组肿瘤组织中mTOR通路相关蛋白的Western blot分析。GAPDH作为上样内参。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
SLC7A5敲低可模拟TGP的抗肿瘤效应
为进一步确认TGP通过下调SLC7A5发挥抑制作用，研究使用小干扰RNA（siRNA）敲低SLC7A5，观察该操作是否能模拟TGP的抗肿瘤效应。细胞分为三组：G1组转染50 nM阴性对照siRNA；G2组转染50 nM阴性对照siRNA后接受TGP处理48小时；G3组转染50 nM SLC7A5-siRNA。
与G1组相比，G2和G3组SLC7A5表达均显著下调。SLC7A5沉默显著抑制细胞增殖、克隆形成和迁移，其表型变化与TGP处理高度一致。SLC7A5敲低还导致细胞内亮氨酸含量显著下降。Western blot显示，SLC7A5敲低显著抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，从而使mTOR/ULK1信号通路失活，这与TGP产生的抑制作用高度一致。此外，SLC7A5敲低也降低EMT标志物蛋白水平，其抑制作用与TGP处理相当。进一步研究显示，SLC7A5过表达会降低HNSCC细胞对TGP的敏感性，而SLC7A5敲低会增强TGP敏感性，提示SLC7A5是决定TGP反应的重要因素。
图8：SLC7A5敲低模拟TGP的抗肿瘤效应，并抑制HNSCC细胞中的mTOR通路。（A）三个实验组示意图：G1，Control；G2，TGP处理；G3，SLC7A5敲低（si-SLC7A5）。（B）CAL27、FADU和SCC7细胞中SLC7A5蛋白表达的代表性Western blot图像（左）及相应定量分析（右）。β-ACTIN作为上样内参。（C）CCK-8实验检测三种处理条件下HNSCC细胞增殖曲线。（D）克隆形成实验显示HNSCC细胞克隆存活能力。（E）Transwell迁移实验显示HNSCC细胞迁移能力。（F）不同处理条件下CAL27、FADU和SCC7细胞培养上清中的亮氨酸浓度。（G）mTOR/ULK1通路关键蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot图像，GAPDH作为上样内参。（H）热图显示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/总蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
TGP抑制HNSCC依赖mTOR信号轴调控
考虑到mTOR通路在细胞稳态和生长调节中的关键作用，研究推测TGP介导的HNSCC抑制依赖该信号轴。为验证因果关系，研究使用特异性mTOR激动剂MHY1485进行药理学扰动实验。
结果显示，MHY1485重新激活mTOR通路后，可显著削弱TGP对细胞增殖、克隆形成和迁移能力的抑制。Western blot也证实，MHY1485可恢复被TGP抑制的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平。相反，使用特异性mTOR抑制剂雷帕霉素可复制TGP产生的肿瘤抑制效应，进一步支持mTOR轴在HNSCC进展中具有重要作用。
图9：MHY1485激活mTOR信号可逆转TGP在HNSCC细胞中的抗增殖和抗克隆形成作用。（A）CAL27、FADU和SCC7细胞经溶剂对照（Control）、TGP单独处理或TGP联合mTOR激活剂MHY1485处理后，通过CCK-8实验检测细胞增殖曲线。（B）克隆形成实验显示相同处理条件下细胞克隆存活能力。（C）Transwell迁移实验显示细胞迁移能力。（D）mTOR通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot分析。GAPDH作为上样内参。（E）热图显示mTOR通路中磷酸化蛋白/总蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
TGP通过SLC7A5选择性限制亮氨酸供应，而非造成非特异性氨基酸剥夺
为系统界定TGP抑制作用的底物特异性，研究分别补充SLC7A5主要转运底物亮氨酸，以及非目标大型氨基酸精氨酸，进行双向营养救援实验。48小时和96小时CCK-8细胞活性实验显示，单独补充亮氨酸或精氨酸均可促进基础生长；但在TGP压力下，二者表现出明显不同的结果。外源亮氨酸可部分缓冲和补偿TGP的细胞毒性，使细胞活力维持在较高水平；相反，精氨酸无法减轻TGP毒性，Arginine+TGP组仍表现出明显细胞死亡。
Transwell迁移实验进一步证实这种底物选择性：外源亮氨酸可部分恢复TGP介导的迁移抑制，而精氨酸完全不能挽救TGP的抗迁移作用。分子水平上，亮氨酸补充在TGP作用下仍可部分维持p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平，提示其可能通过与SLC7A5转运过程相关的竞争性底物补偿机制发挥作用。相反，TGP可完全压制精氨酸驱动的通路激活，未见代谢补偿迹象。
综合来看，TGP并非通过非特异性氨基酸剥夺抑制HNSCC，而是通过阻断SLC7A5介导的亮氨酸输入，选择性削弱肿瘤细胞营养供应和mTOR通路激活。
图10：TGP通过抑制SLC7A5降低细胞内亮氨酸可利用性，引发支链氨基酸分解代谢酶代偿性下调，并抑制HNSCC细胞中的mTOR信号。（A）Western blot分析CAL27、FADU和SCC7细胞经不同浓度TGP（低剂量/高剂量）处理后，支链氨基酸分解代谢关键酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表达，β-ACTIN作为上样内参。（B）TGP处理后，细胞内α-酮异己酸（KIC）水平定量；KIC是亮氨酸分解代谢的关键代谢物。（C、D）HNSCC细胞经溶剂、亮氨酸单独处理、亮氨酸联合TGP处理、精氨酸单独处理或精氨酸联合TGP处理后，在48小时（C）和96小时（D）检测细胞活力。（E）Transwell迁移实验显示相同处理条件下细胞迁移能力。（F）Western blot分析细胞经溶剂、TGP单独处理、亮氨酸联合TGP处理或精氨酸联合TGP处理后，mTOR通路相关蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的表达。β-ACTIN作为上样内参。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
【贡献】★★★★★
本研究证实，TGP可通过靶向SLC7A5-亮氨酸-mTOR信号轴抑制HNSCC。具体而言，TGP下调SLC7A5表达，减少亮氨酸摄取，降低亮氨酸下游代谢物KIC水平，并抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，从而限制HNSCC细胞增殖、克隆形成、迁移和EMT进程，并促进细胞凋亡。
体内实验显示，TGP可抑制CAL27、FADU和SCC7模型中的肿瘤生长，并降低肿瘤组织SLC7A5表达和亮氨酸积累，同时在免疫完整小鼠模型中改善免疫抑制性肿瘤微环境。SLC7A5过表达和mTOR激活可削弱TGP的抗肿瘤效应，而SLC7A5敲低和mTOR抑制可模拟TGP作用，进一步支持SLC7A5-亮氨酸-mTOR轴是TGP发挥作用的关键通路。
该研究不仅拓展了天然产物调控肿瘤代谢重编程的机制认识，也为将TGP开发为HNSCC潜在低毒治疗候选药物提供了临床前证据。不过，研究仍存在局限：尚未使用患者来源异种移植瘤（PDX）模型验证个体化肿瘤异质性；TGP下调SLC7A5的上游分子机制仍未阐明；未来还需进一步评估TGP与HNSCC标准治疗方案联用时是否具有协同潜力。
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