PSA如何测量蛋白的化学稳定性
原创发表：北京佰司特科技有限责任公司 蛋白稳定性分析仪PSA-16
技术原理：
蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长的样子其实都是不同的。
蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。
蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。
蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。
差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)包括两种：染料法DSF、内源DSF（intrinsic DSF）。
最常用的染料法DSF是通过标记染料来检测升温过程中蛋白构象的变化。比如SYPRO Orange，是一种环境敏感的疏水染料，当温度升高时，蛋白去折叠，疏水部分暴露出来，染料与蛋白质的疏水部分特异性结合，荧光增强。在有特定化合物或配体结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升。内源DSF（intrinsic DSF）则是基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测。通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光（350 nm/330 nm比值）的改变，获得蛋白的热变性温度(Tm值)、化学变性浓度（Cm值）等参数，反映蛋白的热稳定性和化学稳定性。相比传统的方法，无需添加染料，通量高，样品用量少，数据精度高。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。
PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。
在进行化学稳定性实验时，在化学变性剂中已经达到平衡的样品，需要在特定的实验温度下进行检测。一般选择盐酸胍或者尿素作为变性剂。盐酸胍的最高浓度一般使用6 M，尿素的最高浓度一般使用8 M。点击“开始试验”按钮进行化学稳定性测试。实验结果会展示自动计算的Cm值和△G值。亦可通过导出原始数据，在第三方软件中进行数据计算。具体步骤如下
Part 01. 实验步骤
1）在进行化学稳定性实验时，在化学变性剂中已经达到平衡的样品，需要在特定的实验温度下进行检测。首先设置试验温度。实验温度可设置的范围为15-110℃，可通过“+”“-”按钮进行调整，步进值为1℃。
2）可以根据样品浓度的不同，选择检测灵敏度。高检测灵敏度适合0.05-1 mg/ml的样品，中检测灵敏度适合1-10 mg/ml的样品，低检测灵敏度适合10 mg/ml以上的样品。
3）设置好以上参数之后，接下来需要输入变性剂的浓度。进行化学稳定性试验时，一般选择盐酸胍或者尿素作为变性剂。盐酸胍的最高浓度一般使用6 M，尿素的最高浓度一般使用8 M。为了获得足够的数据点，推荐使用16个浓度梯度进行化学变性试验。以盐酸胍为例，可以参考以下浓度梯度设计：
4）设置好以上参数之后，可以点击选取需要检测的样品，并可以输入样品名。
5）参数设置完成后，即可点击“预扫描”按钮。仪器会对样品进行扫描，检查荧光值是否符合实验要求。
注释：330 nm和350 nm的荧光值需要在5000-60000之间。在此范围之内荧光值数字会显示为绿色，表示通过。在此范围之外荧光值数字会显示为红色，表示不通过。如果荧光值过低或者过高，可首先通过调整检测灵敏度，再次进行预扫描来获得合适的荧光信号。如果无法通过调整检测灵敏度获得合适的荧光信号，则需要对样品进行稀释或者浓缩。
6） 在预扫描通过后，即可点击“开始实验”按钮进行化学稳定性测试。
Part 02. 实验结果
7）试验完成后，软件会自动进行数据分析并进入结果查看界面。
8） 实验结果会展示自动计算的Cm值和△G值。亦可通过导出原始数据，在第三方软件中进行数据计算。
Part 03. 总结讨论
多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。
1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选
2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等
3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）
4. 抗体偶联药物（ADC）研究
5. 多结构域去折叠特性研究
6. 物理和化学条件强制降解研究
7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）
8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）
9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）
10. 蛋白纯化条件快速优化等
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