2026年6月30日，空军军医大学（第四军医大学）西京医院药剂科牟菲、王婧雯团队，联合浙江花园营养科技有限公司、空军军医大学公共卫生学院等单位，在Drug Delivery （中科院2区，IF=8.0；新锐分区 1区，TOP期刊）在线发表题为“Wedelactone-loaded exosomes for sepsis-induced liver injury: a novel therapeutic strategy”的研究论文。该文于2025年9月16日投稿，2026年1月22日修回，6月18日接收。Drug Delivery在2025年中科院分区中位列医学2区、药学1区，2026年公布的最新影响因子为8.0。
论文共同通讯作者Fei Mu和Jingwen Wang的中文名分别为牟菲和王婧雯，两人均来自空军军医大学第一附属医院西京医院药剂科。既往中文论文所列邮箱和ORCID与本研究通讯作者信息相对应。
脓毒症诱导的肝损伤（sepsis-induced liver injury，SILI）与炎症失控、氧化应激、脂质过氧化和铁死亡密切相关。传统中药活性成分蟛蜞菊内酯（wedelolactone，WEL）具有一定的肝脏保护活性，但其水溶性较差，且缺乏有效的肝脏靶向能力。针对这一问题，研究团队从RAW264.7小鼠巨噬细胞中提取外泌体，并通过超声孵育将WEL装载至外泌体内，构建了载蟛蜞菊内酯外泌体递送系统Exo@WEL。
研究显示，Exo@WEL可提高WEL在小鼠肝脏中的靶向富集和滞留，并在盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型及脂多糖（LPS）刺激的AML12肝细胞模型中，减轻肝细胞损伤、炎症反应、氧化应激和铁死亡。机制研究进一步表明，Exo@WEL可激活核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游SLC7A11/GPX4抗铁死亡通路；使用Nrf2抑制剂ML385后，其抗氧化和线粒体保护作用被部分削弱。该研究为利用外泌体提高天然活性成分的肝脏靶向递送效率提供了实验依据，但目前仍属于细胞和动物模型中的预给药研究，尚不能直接推断其临床疗效。
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【摘 要】
背景与目的：脓毒症诱导的肝损伤（sepsis-induced liver injury，SILI）是影响重症患者预后的重要因素。蟛蜞菊内酯（wedelolactone，WEL）具有肝脏保护活性，但其水溶性较差、靶向能力不足，限制了进一步应用。本研究构建了一种以外泌体（exosome，Exo）为载体的WEL递送系统Exo@WEL，旨在提高WEL的肝脏靶向效率及其在实验性SILI中的保护作用。
方法：研究采用差速离心法从小鼠巨噬细胞系RAW264.7中提取外泌体，并通过超声孵育将WEL装载至外泌体中。采用透射电子显微镜（TEM）、粒径分析、纳米颗粒跟踪分析（NTA）及纳米流式细胞术对Exo@WEL进行表征。利用近红外荧光染料DiR标记外泌体，评价其在小鼠体内的分布及肝脏靶向能力。随后，在CLP诱导的SILI小鼠模型及LPS刺激的AML12肝细胞模型中，评价Exo@WEL对肝损伤、炎症、氧化应激和铁死亡的影响，并使用Nrf2选择性抑制剂ML385验证相关分子机制。
结果：Exo@WEL保留了典型的外泌体囊泡结构和表面标志蛋白，其平均粒径约为120～130 nm。DiR示踪结果显示，与未载药外泌体相比，Exo@WEL在肝脏中的靶向富集明显增强，并可延长药物在肝脏中的滞留时间。
在SILI模型中，Exo@WEL对肝脏的保护作用优于游离WEL。Exo@WEL可降低ALT、AST和LDH水平，减轻肝组织损伤和炎症细胞浸润，下调TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎因子，并改善谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等氧化应激指标。与此同时，Exo@WEL可减少活性氧（ROS）生成和肝组织铁积聚，改善线粒体超微结构，并抑制铁死亡。
机制研究显示，Exo@WEL可上调Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达。Nrf2抑制剂ML385可部分削弱Exo@WEL降低ROS、维持线粒体膜电位及恢复SLC7A11和GPX4表达的作用，表明Nrf2通路是Exo@WEL发挥肝脏保护作用的重要调控环节。
结论：本研究构建了具有肝脏靶向能力的Exo@WEL纳米递送系统。该系统可通过调控Nrf2/SLC7A11/GPX4信号轴，减轻实验性SILI中的氧化应激、炎症反应和铁死亡，为基于外泌体的天然活性成分靶向递送提供了新的实验思路。
01
研究背景及科学问题
脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调所引起的危及生命的全身性综合征，可导致严重免疫功能紊乱和多器官功能衰竭。脓毒症仍是重症监护环境中的主要死亡原因之一，其后期持续存在的炎症、免疫抑制和分解代谢综合征，是造成患者死亡的重要因素。
不同国家和地区的脓毒症住院死亡率存在明显差异。在高收入国家，依据Sepsis-3标准统计的住院死亡率约为15%～25%；在中低收入国家，由于医疗资源可及性有限，成年脓毒症患者的住院死亡率中位数可达到30%，在部分医疗资源极度匮乏的环境中甚至可能超过50%。
肝脏血流丰富，在全身感染过程中承担免疫调节和代谢调控等重要功能。肝损伤不仅可反映脓毒症的严重程度，也与患者临床结局密切相关。除肝脏外，脓毒症还常引起急性肾损伤、心肌损伤和肺损伤等多器官并发症。因此，在干预SILI的同时兼顾其他器官保护，可能有助于形成更加全面的脓毒症干预策略。
外泌体是来源于内体系统的一类细胞外囊泡，内部含有蛋白质、氨基酸、核酸、脂质及代谢物等多种生物活性成分，可通过将这些物质传递至受体细胞而调控其生物学功能。外泌体还可参与抗原呈递以及免疫细胞的成熟、分化和活化，目前已被广泛研究为药物和生物活性分子的递送载体。
现有研究提示，外泌体可能成为脓毒症肝损伤的重要干预工具。例如，间充质干细胞来源外泌体可通过调控非编码RNA或巨噬细胞相关信号减轻脓毒症肝损伤；干细胞来源外泌体还可能通过降低炎症因子水平和组织损伤，减轻脓毒症引起的炎症反应。不过，外泌体干预脓毒症肝损伤的具体机制仍有待进一步明确。
近年来，氧化应激被认为是SILI发生和进展的重要环节。氧化应激是机体促氧化系统与抗氧化系统之间失衡的状态，可触发脂质过氧化、抗氧化物质耗竭及细胞信号通路紊乱等一系列病理变化。
铁死亡是一种以铁依赖性脂质自由基积聚为特征的调节性细胞死亡形式，其发生与氧化应激密切相关。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活和脂质过氧化物积聚是铁死亡的重要特征。抑制肝细胞铁死亡有望减轻SILI中的组织损伤和炎症浸润。
核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是维持细胞氧化还原稳态的重要转录因子，也是连接氧化应激和铁死亡的关键调控节点。Nrf2激活后可促进HO-1、SLC7A11和GPX4等抗氧化及抗铁死亡分子的表达，从而减少氧化损伤和脂质过氧化。不过，氧化应激与铁死亡在SILI中的协同作用及其可干预机制仍需深入研究。
蟛蜞菊内酯是从传统中药植物中分离得到的一种植物香豆素类化合物。已有研究表明，其肝脏保护作用可能与抑制氧化应激、炎症和细胞死亡等过程有关。然而，WEL水溶性较差且缺乏足够的靶向能力，限制了其在SILI中的进一步开发。
巨噬细胞来源外泌体具有在动物肝脏中富集的特性，因而可能成为WEL的潜在靶向递送载体。基于此，本研究构建了载蟛蜞菊内酯外泌体系统Exo@WEL，旨在实现WEL向肝损伤部位的有效递送，并系统评价其在SILI中的肝脏保护作用及相关分子机制。
02
重要发现及亮点
Exo@WEL的制备及HPLC鉴定
研究团队首先从RAW264.7小鼠巨噬细胞培养液中分离外泌体，并按照外泌体与WEL质量比6∶1进行混合。通过超声处理暂时改变外泌体膜结构，使WEL进入囊泡内部；随后在37 ℃条件下孵育，使外泌体膜结构恢复稳定，最终获得Exo@WEL。
为了评价WEL的装载情况，研究采用高效液相色谱（HPLC）建立定量方法。在0～80 μg/mL范围内，WEL浓度与色谱峰面积呈良好线性关系，回归方程为Y=39645X−6070，R²=0.9996。Exo@WEL经破膜后释放出的WEL，其色谱保留时间与WEL标准品一致，表明WEL已成功进入外泌体制剂。
图1：Exo@WEL的表征。（A）Exo@WEL制备流程图。（B）WEL的化学结构。（C）WEL标准曲线，n=3。（D）Exo@WEL的HPLC检测结果，n=3。
Exo@WEL保留典型外泌体结构并具有较好的稳定性
透射电子显微镜观察显示，Exo和Exo@WEL均呈现典型的囊泡样结构。两者Zeta电位均约为−10 mV，平均粒径约为120～130 nm，且粒径分布相对均匀。
纳米流式细胞术检测显示，Exo和Exo@WEL均表达CD9、CD63及CD81等外泌体标志蛋白，提示WEL装载后并未明显破坏外泌体的基本结构特征。
HPLC定量分析显示，Exo@WEL的包封率为25.97%±3.58%，载药率为4.14%±0.14%。连续7天稳定性检测表明，制剂的粒径和包封率总体保持稳定。体外释放实验显示，Exo@WEL在24小时内的WEL累积释放率达到约80%。
图2：外泌体表征。（A）Exo和Exo@WEL的透射电子显微镜图像，比例尺=500 nm。（B）Exo和Exo@WEL的Zeta电位分布。（C）Exo和Exo@WEL的粒径分布。（D）Exo和Exo@WEL中CD9、CD63及CD81蛋白的表达。（E）Exo@WEL的稳定性，n=3。（F）Exo@WEL在磷酸盐缓冲液（PBS）中的WEL累积释放量，n=3。
Exo@WEL增强药物在小鼠肝脏中的靶向富集
为评价Exo@WEL在体内的分布，研究使用近红外荧光染料DiR标记Exo和Exo@WEL，并在给药后0、1、2、4、8、12和24小时进行小动物活体成像。
结果显示，Exo@WEL进入体内后迅速在肝脏区域富集，给药后约2小时达到荧光峰值，随后逐渐下降，但24小时后仍可检测到明显信号。与Exo组相比，Exo@WEL组肝脏区域的荧光信号总体更强。
离体器官成像显示，外泌体信号主要分布在肝脏和脾脏，其中Exo@WEL在肝脏中的积聚最为突出。肝脏离体成像和冰冻切片检测也显示，Exo@WEL组的肝脏荧光强度显著高于Exo组，说明WEL负载后的外泌体具有较强的肝脏富集能力。
图3：外泌体在小鼠体内的肝脏靶向性。（A）小鼠肝脏区域外泌体分布的活体荧光分析。（B）24小时内小鼠肝脏荧光信号的定量结果，n=3，*p<0.05，**p<0.01。（C）外泌体在小鼠主要器官中的分布，包括肝、脾、心、肺和肾。（D）主要器官荧光信号的定量结果，n=3。（E）小鼠离体肝脏的平均荧光强度。（F）离体肝脏荧光信号的定量结果，n=3，**p<0.01。（G）外泌体在小鼠肝组织中的靶向分布，比例尺=50 μm。（H）Exo和Exo@WEL荧光信号的定量结果，n=3。
Exo@WEL具有较好的初步生物安全性并减轻肝损伤
研究首先从组织病理学、肾功能和血常规等方面评价Exo@WEL的初步安全性。给药后，小鼠肝、心、脾、肺及肾组织未见明显结构损伤，组织细胞排列相对完整。
血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、白细胞（WBC）及红细胞（RBC）等指标均处于相应正常范围，提示在本研究的给药条件和观察时间内，Exo@WEL未引起明显的肾功能或造血系统异常。
在CLP诱导的SILI模型中，模型组小鼠肝脏表面粗糙并出现结节样改变。WEL和Exo@WEL干预后，肝脏表面逐渐恢复平滑，其中Exo@WEL组改善更明显。
生化检测显示，Exo@WEL显著降低CLP诱导的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高，且改善幅度大于游离WEL。CLP后肝脏重量比有所降低，但各治疗组之间差异未达到统计学意义。此外，Exo@WEL显著减少了肝组织中的亚铁离子积聚。
图4：Exo@WEL的安全性及干预效果评价。（A）小鼠肝、心、脾、肺和肾组织的H&E染色，比例尺=20 μm。（B）Exo@WEL对小鼠血清BUN和CREA指标的影响。（C）Exo@WEL对小鼠血液WBC和RBC指标的影响；绿色背景表示正常范围，n=6。原文图注将C项误写为BUN和CREA，图中实际指标为WBC和RBC。（D）CLP后24小时的肝脏大体形态。（E）WEL和Exo@WEL对CLP小鼠血清ALT及AST水平的影响。（F）CLP后24小时的肝脏重量比，n=8。（G）肝组织亚铁离子含量，n=6。#<0.01；*p<0.05，**p<0.01。
Exo@WEL减轻小鼠肝脏炎症、氧化应激和线粒体损伤
H&E染色显示，Sham组肝组织结构正常，而CLP组出现明显的肝细胞排列紊乱和炎症细胞浸润。WEL和Exo@WEL均可减轻上述病理改变，Exo@WEL的改善更为明显。
CLP模型组呈现典型的氧化应激和铁死亡相关变化，表现为血清SOD和GSH水平下降、MDA水平升高。WEL可部分逆转这些变化，而Exo@WEL使SOD和GSH进一步恢复，并更加显著地降低MDA。
透射电子显微镜显示，CLP组肝细胞线粒体出现明显收缩、嵴断裂和结构破坏；Exo@WEL可改善线粒体形态，使其结构更接近正常状态。
炎症因子检测显示，CLP显著升高血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，而Exo@WEL可抑制上述促炎因子的过度释放。肝组织免疫荧光检测进一步显示，Exo@WEL显著减少ROS信号，提示其能够增强肝组织的抗氧化防御能力。
图5：Exo@WEL抑制小鼠炎症反应和氧化应激。（A）肝组织H&E染色所示的病理学变化，比例尺=20 μm。（B—D）血清SOD、MDA和GSH水平，n=6。（E）肝组织线粒体结构变化，比例尺=2 μm。（F—H）血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，n=6。（I）共聚焦显微镜检测肝组织ROS荧光强度，比例尺=50 μm。（J）ROS相对生成量，n=6。#<0.01；*p<0.05，**p<0.01。
Exo@WEL激活小鼠肝脏Nrf2/SLC7A11/GPX4通路
为阐明Exo@WEL抑制氧化应激和铁死亡的机制，研究检测了Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4等关键蛋白。
免疫荧光和Western blot结果一致显示，CLP降低了上述抗氧化和抗铁死亡蛋白的表达。WEL可在一定程度上恢复其表达，而Exo@WEL的调节作用更为明显。
Nrf2激活后可促进HO-1表达，并通过SLC7A11促进胱氨酸摄取和GSH合成，为GPX4清除脂质过氧化物提供基础。Exo@WEL通过上调这一信号轴，可能增强肝细胞的抗氧化能力，减少脂质过氧化和铁死亡。
图6：Exo@WEL抑制小鼠肝脏氧化应激和铁死亡。（A—D）采用免疫荧光染色检测Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4的表达，比例尺=50 μm。（E—H）免疫荧光所示Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4表达水平的定量分析，n=3。（I）采用Western blot检测Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4的表达。（J—M）Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4表达水平的统计分析，n=3。#<0.01；*p<0.05，**p<0.01。
Exo@WEL提高AML12肝细胞摄取并改善生物相容性
CCK-8实验显示，在0～25.6 μg/mL浓度范围内，WEL和Exo@WEL均未显著影响AML12细胞活力。当浓度升高至51.2 μg/mL时，游离WEL表现出明显细胞毒性，而Exo@WEL仍维持较好的细胞相容性。因此，后续实验选用25.6 μg/mL作为工作浓度。
共聚焦显微镜显示，DiR标记的Exo和Exo@WEL均可被AML12细胞摄取，并呈现明显的时间依赖性。随着孵育时间由6小时延长至12和24小时，细胞内荧光信号逐渐增强。Exo@WEL组在12和24小时的荧光强度高于Exo组，提示其具有较高的肝细胞摄取效率。
图7：肝细胞对外泌体的摄取。（A—B）不同浓度WEL和Exo@WEL对AML12细胞的细胞毒性，n=6。（C）采用共聚焦激光扫描显微镜检测LPS处理AML12细胞对DiR标记外泌体的摄取，比例尺=10 μm；DiR为红色，DAPI标记细胞核为蓝色。（D）细胞摄取荧光信号的定量分析，n=3。*p<0.05，**p<0.01。
Exo@WEL减轻LPS诱导的肝细胞损伤和氧化应激
在LPS诱导的AML12肝细胞损伤模型中，细胞上清液ALT、AST和乳酸脱氢酶（LDH）水平均明显升高。WEL和Exo@WEL均可降低上述指标，其中Exo@WEL的作用更加显著。
透射电子显微镜显示，LPS处理引起线粒体嵴破坏、膜结构凝集等超微结构异常；Exo@WEL可减轻这些线粒体损伤。
氧化应激检测显示，LPS降低SOD和GSH水平并升高MDA，Exo@WEL可明显逆转这些变化。免疫荧光结果还显示，Exo@WEL恢复了LPS处理后下降的Nrf2表达。
图8：Exo@WEL减轻脓毒症相关肝细胞损伤。（A—C）细胞上清液ALT、AST和LDH水平，n=6。（D）采用透射电子显微镜观察线粒体变化，比例尺=2 μm，n=3。（E—G）细胞培养上清液SOD、MDA和GSH水平，n=6。（H）采用免疫荧光染色检测Nrf2表达，Nrf2为绿色，DAPI标记细胞核为蓝色，比例尺=50 μm。（I）Nrf2表达水平的统计分析，n=3。#<0.01；**p<0.01。
细胞实验进一步验证Nrf2/SLC7A11/GPX4通路
Western blot结果显示，LPS刺激显著降低AML12细胞中Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4表达。WEL可部分恢复这些蛋白，而Exo@WEL的恢复作用更强。
炎症因子检测进一步表明，LPS显著提高TNF-α、IL-6和IL-1β水平。与游离WEL相比，Exo@WEL对上述促炎因子的抑制更明显。
这些结果与动物实验一致，说明Exo@WEL可同时调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号、氧化应激、铁死亡和炎症反应，从而对LPS诱导的肝细胞损伤产生综合保护作用。
图9：Exo@WEL抑制AML12细胞中的肝细胞氧化应激和铁死亡。（A）采用Western blot检测Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4的表达。（B—E）相应蛋白表达水平的统计分析，n=3。（F—H）细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，n=6。#<0.01；**p<0.01。
抑制Nrf2可部分削弱Exo@WEL的抗氧化和抗铁死亡作用
为验证Nrf2在Exo@WEL作用中的必要性，研究在AML12细胞中加入Nrf2抑制剂ML385。
LPS处理显著增加肝细胞内ROS水平，加入ML385后，氧化应激进一步加重。Exo@WEL可显著降低ROS，但在同时加入ML385后，这种抑制作用被部分抵消，表明Exo@WEL降低ROS的作用至少部分依赖Nrf2激活。
研究进一步使用JC-1荧光探针评价线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）。正常线粒体膜电位较高时，JC-1主要形成红色聚集体；当膜电位下降时，绿色单体信号增强。结果显示，LPS导致红色/绿色荧光比值下降，提示线粒体膜电位受损；ML385使这一损伤进一步加重。Exo@WEL可恢复线粒体膜电位，但ML385可部分削弱其保护作用。
Western blot结果显示，ML385降低了Nrf2及其下游HO-1、SLC7A11和GPX4的表达。Exo@WEL可逆转LPS引起的这些蛋白下调，但在Nrf2受到抑制后，其恢复幅度明显减弱。
上述结果说明，Nrf2是Exo@WEL调节抗氧化防御和铁死亡的重要通路，但ML385仅能部分逆转其保护作用，提示Exo@WEL可能还通过其他分子机制产生作用。
图10：抑制Nrf2可部分抵消Exo@WEL抑制肝细胞铁死亡的作用。（A）共聚焦显微镜检测ROS荧光强度，ROS为绿色，比例尺=20 μm。（B）ROS相对生成量。（C—D）采用JC-1探针检测AML12细胞线粒体膜电位损伤；JC-1单体为绿色，JC-1聚集体为红色，比例尺=20 μm。（E—I）采用Western blot检测GPX4、SLC7A11、HO-1和Nrf2表达，并进行相对表达量分析，n=6。#<0.01；*p<0.05，**p<0.01；△p<0.05，△△p<0.01。
机制示意图总结
研究提出，Exo@WEL通过外泌体的肝脏富集特性，将WEL递送至受损肝组织和肝细胞。进入肝细胞后，Exo@WEL激活Nrf2，并促进HO-1、SLC7A11和GPX4表达。
SLC7A11促进胱氨酸摄取，为GSH合成提供底物；GPX4利用GSH还原脂质过氧化物，减少ROS和脂质过氧化积聚。上述过程有助于维持线粒体功能、减少铁依赖性氧化损伤并抑制铁死亡。
与此同时，Exo@WEL还降低TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎因子水平，从而协同减轻脓毒症相关肝细胞损伤。Nrf2抑制剂ML385可部分阻断该作用链条，进一步支持Nrf2/SLC7A11/GPX4轴在这一过程中的重要作用。
图11：Exo@WEL的构建及潜在作用机制。（A）Exo@WEL合成示意图。研究从RAW264.7巨噬细胞培养液中分离外泌体，通过超声和孵育装载WEL，并在给药后建立CLP诱导的脓毒症肝损伤小鼠模型。（B）Exo@WEL在小鼠SILI及肝细胞中的作用机制。Exo@WEL激活Nrf2及下游HO-1、SLC7A11、GSH和GPX4相关抗氧化通路，减少ROS、脂质过氧化和Fe²⁺相关铁死亡，从而减轻肝损伤；Nrf2抑制剂ML385可抑制该信号过程。
【贡献】★★★★★
本研究成功构建了一种具有肝脏靶向能力的外泌体递送系统Exo@WEL，并提高了WEL在实验性SILI模型中的作用效果。
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