核糖核酸及其化学修饰衍生物在基础研究和生物医学领域应用广泛，然而传统的固相化学合成法在合成长链RNA及部分修饰RNA时效率低下，并且难以在序列任意位点实现可控标记。尽管工程化聚合酶的出现为解决上述问题提供了新思路，但如何高效、精准地在RNA和修饰RNA的特定位置引入功能性标记，仍然是领域内亟待突破的瓶颈。2026年8月14日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授团队在国际学术期刊《自然·通讯》（Nature Communications）在线发表题为“Engineered polymerase-mediated efficient synthesis of site-specifically functionalized RNA and 2'-modified RNA oligonucleotides via genetic alphabet expansion”的研究论文。该研究系统表征了工程化聚合酶SFM4-6识别并合成非天然碱基对的能力，在此基础上开发了多种RNA及2'-修饰RNA寡核苷酸的位点特异性标记方法，成功制备了多种功能性RNA分子并验证了其活性。
研究团队首先系统测试了SFM4-6聚合酶对于非天然碱基对dNaM-dTPT3及其多种衍生物的识别与合成活性。凝胶电泳分析结果显示，在含有dNaM核苷酸的DNA模板上，SFM4-6能够高效且特异性地将dTPT3、rTPT3或它们的氨基、炔基修饰衍生物掺入到延伸链中。稳态动力学实验进一步定量揭示，该酶催化dNaM-dTPT3合成的效率（kcat/Km值为1.33×10^5 mM⁻¹·min⁻¹）与天然dA-dT碱基对的合成效率处于同一数量级，而催化自身配对dNaM-dNaM的效率则低了近两个数量级。这一结果表明SFM4-6对非天然碱基对具有高度的底物选择性，为其后续用于功能化RNA的酶法合成奠定了坚实的酶学基础。
在确认SFM4-6的碱基识别特性之后，研究人员利用含有dNaM的DNA模板指导RNA或多种2'-修饰RNA（包括2'-F-CU-RNA、2'-F/OMe-RNA和2'-OMe-RNA）的合成。实验证实，聚合酶能在RNA链的特定内部位点精准掺入单个dTPT3或rTPT3核苷酸或其功能性类似物。随后通过DNase I处理去除DNA模板和引物，并结合NHS酯或叠氮-炔环加成反应，研究团队成功实现了对这些RNA分子的内部位点特异性荧光或生物素标记。质谱分析结果确认了掺入位点的正确性以及产物的高纯度，证明该方法适用于多种化学修饰骨架的RNA。
为了摆脱对含非天然碱基DNA模板的依赖，团队开发了“受控暂停与重启”引物延伸策略。该方法利用天然DNA模板，先由SFM4-6将单个dTPT3或rTPT3核苷酸掺入到引物末端，随后通过添加天然或修饰的核糖核苷三磷酸重启延伸反应，完成全长RNA的合成。稳态动力学测定显示，该酶催化dTPT3掺入到模板dA位点的效率最高，而后续天然核苷酸的掺入效率又比dTPT3高出1到2个数量级，确保了标记反应的特异性与产率。利用此方法，他们成功制备了5'端携带非天然碱基的RNA及多种修饰RNA，并进一步偶联了荧光染料和生物素。
研究团队进一步将该方法应用于功能性RNA分子的制备与验证。他们合成了5'端TAMRA标记的GFP-siRNA，转染B16-OVA(GFP)细胞后，共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析显示，超过98%的细胞成功摄取了siRNA，并且95%以上的细胞GFP表达被显著敲低。团队还制备了5'端FAM标记的2'-F-CU-RNA凝血酶适配体和三种靶向蜡样芽孢杆菌金属-β-内酰胺酶的2'-F/OMe-RNA适配体，凝胶迁移实验均证实这些标记后的适配体保持了良好的靶蛋白结合活性。
最后，团队利用SFM4-6在非天然碱基对和错配底物上活性的差异，发展了RNA和修饰RNA的双标记技术。他们在一个2'-F-CU-RNA分子的5'端引入dTPT3Am、内部位点引入dTPT3Al，分别偶联TAMRA和AF488，成功制备了双荧光标记的RNA。基于此策略，团队还构建了5'端Dabcyl淬灭基团和3'端FAM荧光基团双重修饰的凝血酶适配体传感器，加入靶蛋白后荧光恢复至原有水平的94%以上，而加入牛血清白蛋白则无显著变化，展现了该传感器良好的特异性和响应性能。
READING
BioPeers
热门跟贴